Özet

Constitution génétique biosynthétisée L-dihydroxyphénylalanine (DOPA) et son Application à la conjugaison de protéine

Published: August 24, 2018
doi:

Özet

Nous présentons ici un protocole pour la constitution génétique de L-dihydroxyphénylalanine biosynthétisée à partir de matières premières simples et son application à la conjugaison de la protéine.

Abstract

L-dihydroxyphénylalanine (DOPA) est un acide aminé présent dans la biosynthèse des catécholamines dans les animaux et les plantes. En raison de ses propriétés biochimiques particulières, l’acide aminé a des utilisations multiples applications biochimiques. Ce rapport décrit un protocole pour la constitution génétique de biosynthétisée DOPA et son application à la conjugaison de la protéine. DOPA est biosynthétisée par une tyrosine phénol-lyase (TPL) de catéchol, le pyruvate et l’ammoniac et l’acide aminé est incorporé directement dans des protéines par la méthode de constitution génétique utilisant un aminoacyl-tRNA évoluée et paire d’aminoacyl-tRNA synthétase. Ce système d’incorporation directe intègre efficacement DOPA avec peu d’incorporation d’autres acides aminés naturels et avec le meilleur rendement de protéine que le précédent système de constitution génétique pour DOPA. Conjugaison de protéine avec des protéines contenant de DOPA est efficace et spécifique au site et montre son utilité pour des applications diverses. Ce protocole prévoit scientifiques de protéine avec des procédures détaillées pour la biosynthèse efficace de protéines mutantes contenant DOPA aux sites désirés et leur conjugaison pour applications industrielles et pharmaceutiques.

Introduction

DOPA est un acide aminé impliqué dans la biosynthèse des catécholamines dans les animaux et les plantes. Cet acide aminé est synthétisé à partir de Tyr par la tyrosine hydroxylase et la molécule de dioxygène (O2)1. Parce que la DOPA est un précurseur de la dopamine et peut pénétrer la barrière hémato – encéphalique, il a été utilisé dans le traitement de la maladie de Parkinson,2. DOPA se trouve également dans les protéines d’adhérence moule (cartes), qui sont responsables des propriétés adhésives des moules dans des conditions humides3,4,5,6,7. Tyr est initialement codé dans les positions où la DOPA se trouve dans les cartes et est ensuite converti en DOPA par tyrosinases8,9. En raison de ses propriétés biochimiques intéressantes, DOPA a été utilisé dans une variété d’applications. Le groupe dicarbométhoxyl de DOPA est chimiquement sujets à l’oxydation, et l’acide aminé est facilement transformé en L-dopaquinone, un précurseur des mélanines. En raison de son caractère électrophile haut, L-dopaquinone et ses dérivés ont été utilisés pour la réticulation et conjugaison avec les thiols et amines10,11,12,13. 1, 2-quinones peuvent également fonctionner comme un diène pour les réactions de cycloaddition et ont été utilisés pour bioconjugaison par contrainte-favorisé oxydation contrôlée cyclooctyne-1,2-quinone (SPOCQ) cycloaddition14. En outre, le groupe dicarbométhoxyl peut chélater les ions métalliques tels que Fe3 + et Cu2 +, et les protéines contenant DOPA ont été utilisés pour l’administration des médicaments et des ions métalliques détection15,16.

DOPA a été génétiquement incorporé dans les protéines en utilisant un orthogonal aminoacyl-ARNt (aa-ARNt) et aminoacyl-ARNt synthétase (RAA) paire17 et utilisé pour la protéine conjugaison et réticulation10,11, 12,,13. Dans le présent rapport, les résultats expérimentaux et des protocoles pour la constitution génétique de DOPA biosynthétisée à partir de matières premières bon marchés et de ses applications à bioconjugaison sont décrits. DOPA est biosynthétisée à l’aide d’un TPL et à partir de catéchol, le pyruvate et l’ammoniac chez Escherichia coli. La biosynthèse DOPA est directement incorporée dans les protéines en exprimant une paire aa-ARNt et aaRS évoluée pour DOPA. En outre, la protéine biosynthétisée contenant la DOPA est relativement conjuguée avec une sonde fluorescente et réticulé pour produire des oligomères de protéine. Ce protocole sera utile pour les scientifiques de protéine, à biosynthétiser les protéines mutantes contenant DOPA et conjuguer les protéines avec sondes biochimiques ou de médicaments destinés à des applications industrielles et pharmaceutiques.

Protocol

1. Construction de plasmide Construire un plasmide d’expression (pBAD-double-TPL-GFP-WT) qui exprime le gène TPL de Citrobacter freundii , sous le contrôle d’un promoteur constitutif et le gène de la protéine fluorescente verte (GFP) avec un son6-tag sous le contrôle de la araBAD promoteur. Pour pBAD-double-TPL-GFP-E90TAG, remplacer le codon pour le site (E90) de DOPA avec un codon ambre (TAG), à l’aide d’un protocole de mutagénèse dirigée. Les détails pour la construction …

Representative Results

Le système d’expression pour l’incorporation directe de DOPA biosynthétisée à partir d’un TPL est illustré à la Figure 1. Les gènes codant pour la paire aa-ARNt et aaRS évoluée sont placés dans un plasmide, et le gène de la GFP (GFP-E90TAG) contenant un codon ambre à la position 90 se trouve dans un autre plasmide pour évaluer l’incorporation de DOPA par fluorescence GFP. Le gène TPL est placé dans le même plasmide d’expression conte…

Discussion

Dans ce protocole, la biosynthèse et l’incorporation directe de DOPA sont décrites. La cellule bactérienne utilisée dans cette méthode peut synthétiser un acide aminé supplémentaire et utilisez-le comme un bloc de construction artificiel pour la synthèse des protéines. La constitution génétique des acides aminés non naturels a été une technologie clé pour le développement de l’organisme contre nature avec un code génétique élargi. Toutefois, cette méthode a été techniquement incomplète et est …

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par le programme de recherche Global Frontier (FRO-2015M3A6A8065833), et le programme de recherche sciences fondamentales (2018R1A6A1A03024940) grâce à la Fondation de recherche National de Corée (NRF) financé par le gouvernement de la Corée.

Materials

1. Plasmid Construction
Plasmid pBAD-dual-TPL-GFP-E90TAG optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)
Plasmid pEvol-DHPRS2 1. Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) 2. Kim, S., Sung, B. H., Kim, S. C., Lee, H. S. Genetic incorporation of l-dihydroxyphenylalanine (DOPA) biosynthesized by a tyrosine phenol-lyase. Chem. Commun. 54 (24), 3002-3005, doi: 10.1039/c8cc00281a (2018).
DH10β Invitrogen C6400-03 Expression Host
Plasmid Mini-prep kit Nucleogen 5112 200/pack
Agarose Intron biotechnology 32034 500 g
Ethidium bromide Alfa Aesar L07482 1 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
2. Culture preparation
2.1) Electroporation
Micro pulser  BIO-RAD 165-2100
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2089 0.1 cm electrode gap, pkg. of 50
Ampicillin Sodium Wako 018-10372 25 g
Chloramphenicol Alfa Aesar B20841 25 g
Agar SAMCHUN 214230 500 g
SOC medium Sigma S1797 100 mL
3. Expression and Purification of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
3.1 Expression of GFP-E90DOPA by biosynthetic system
L(+)-Arabinose, 99% Acros 104981000 100 g
Pyrocatechol, 99% SAMCHUN P1387 25 g
Ammonium sulfate, 99% SAMCHUN A0943 500 g
pyruvic acid, 98% Alfa Aesar A13875 100 g
Sodium phosphate dibasic, anhydrous, 99% SAMCHUN S0891 1 kg
Potassium phophate, monobasic, 99% SAMCHUN P1127 1 kg
Magnesium sulfate, anhydrous, 99% SAMCHUN M0146 1 kg
D(+)-Glucose, anhydrous, 99% SAMCHUN D0092 500 g
Glycerol, 99% SAMCHUN G0269 1 kg
Trace metal mix a5 with co Sigma 92949 25 mL
L-Proline, 99% SAMCHUN P1257 25 g
L-Phenylalanine, 98.5% SAMCHUN P1982 25 g
L-Tryptophane JUNSEI 49550-0310 25 g
L-Arginine, 98% SAMCHUN A1149 25 g
L-Glutamine, 98% JUNSEI 27340-0310 25 g
L-Asparagine monohydrate, 99% SAMCHUN A1198 25 g
L-Methionine JUNSEI 73190-0410 25 g
L-Histidine hydrochloride monohydrate, 99% SAMCHUN H0604 25 g
L-Threonine, 99% SAMCHUN T2938 25 g
L-Leucine JUNSEI 87070-0310 25 g
Glycine, 99% SAMCHUN G0286 25 g
L-Glutamic acid, 99% SAMCHUN G0233 25 g
L-Alanine, 99% SAMCHUN A1543 25 g
L-Isoleucine, 99% SAMCHUN I1049 25 g
L-Valine, 99% SAMCHUN V0088 25 g
L-Serine SAMCHUN S2447 25 g
L-Aspartic acid SAMCHUN A1205 25 g
L-Lysine monohydrochloride, 99% SAMCHUN L0592 25 g
3.2 Cell lysis
Imidazole, 99% SAMCHUN I0578 1kg
Sodium phosphate monobasic, 98% SAMCHUN S0919 1 kg
Sodium Chloride, 99% SAMCHUN S2907 1 kg
Ultrasonic Processor – 150 microliters to 150 milliliters SONIC & MATERIALS VCX130
3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography
Ni-NTA resin QIAGEN 30210 25 mL
Polypropylene column QIAGEN 34924 50/pack, 1 mL capacity
4. Oligomerization of Purified GFP-E90DOPA 
Sodium periodate, 99.8& Acros 419610050 5 g
5. Conjugation of GFP-E90DOPA with an Alkyne Probe by Strain-Promoted Oxidation-Controlled Cyclooctyne–1,2-Quinone Cycloaddition (SPOCQ) 
Cy5.5-ADIBO  FutureChem FC-6119 1mg
6. Purification of Labeled GFP
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters MILLIPORE UFC500396 96/pack, 500ul capacity
7. SDS-PAGE Analysis and Fluorescence Gel Scanning
1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % Sigma 10708984001 10 g
NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X Thermofisher NP0007 10 mL
MES running buffer Thermofisher NP0002 500 mL
Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels Thermofisher NO0321 12 well
Coomassie Brilliant Blue R-250 Wako 031-17922 25 g
G:BOX Chemi Fluorescent & Chemiluminescent Imaging System Syngene G BOX Chemi XT4
8. MALDI-TOF MS analysis by Trypsin Digestion
8.1 Preparation of the digested peptide sample by trypsin digestion
Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% SAMCHUN T1351 500 g
Hydrochloric acid, 35~37% SAMCHUN H0256 500 mL
Dodecyl sulfate sodium salt, 85% SAMCHUN D1070 250 g
Iodoacetamide Sigma I6125 5 g
Trypsin Protease, MS Grade Thermofisher 90057 5 x 20 µg/pack
C-18 spin columns Thermofisher 89870 25/pack, 200 µL capacity
8.2 Analysis of the digested peptide by MALDI-TOF
Acetonitirile, 99.5% SAMCHUN A0125 500 mL
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid Sigma C2020 10 g
Trifluoroacetic acid, 99% SAMCHUN T1666 100 g
MTP 384 target plate ground steel BC targets Bruker 8280784
Bruker Autoflex Speed MALDI-TOF mass spectrometer Bruker

Referanslar

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Bu Makaleden Alıntı Yapın
Kim, S., Lee, H. S. Genetic Incorporation of Biosynthesized L-dihydroxyphenylalanine (DOPA) and Its Application to Protein Conjugation. J. Vis. Exp. (138), e58383, doi:10.3791/58383 (2018).

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