3-ニトロチロシン大気環境を介して高性能液体クロマトグラフィー-電気化学検出器システムの検出

1. 合計中断午後タンパク質の粒子、PM2.5、または午後7、および加水分解法 プレフィルターまたはバックアップ フィルターから PM を収集します。 総浮遊粒子 (TSP)、PM2.5、および午後7集の前に水晶フィルターの重量を量る。注: 与え午後タンパク質・ ペプチドによる汚染ニトロ化チロシンの検出に影響はありません (彼らはこのようなニトロ グループを欠いている) として、我々 は高温測定の前に水晶フィルターを治療しませんでした。さらに、水晶フィルターで 3 NT コンテンツは検出限界の下にあった HPLC-ECD によって決定されます。 7 d (図 1 b) の継続 1,000 L/分の流量で午後7を収集する粒子サイズ セレクター付き大容量空気サンプラーに水晶フィルターを設定します。TSP は、水晶フィルター サイズ セレクター (図 1 a) なしに収集できます。 PM2.5 7 連続 116 L/分の流量でサイズの分類単位で少量の空気サンプラーの使用を収集 d. このユニットを使用して粒子を小さじ PM15、午後15 7.3、午後7.3 4.5PM4.5 2.5に分類できます、水晶フィルターの分類のために収集します。PM2.5は、バックアップ フィルター (図 1) に収集できます。 フィルター コレクションの時に積算流量を記録します。TSP は、重量を測定午後2.5、および postcollection 重量から precollection の重量を差し引くことによってフィルターに PM7 。ビニール袋にフィルターのシール、-30 ° C で次のステップ (セクション 2 を参照) まで保存できます。 Proteolyze サンプル。 0.1 M 酢酸緩衝液 (pH 7.4) と非特異的なプロテアーゼ カクテルを溶解します。透析膜に溶液を入れ (カットオフ分子量 5,000 Da =) し、4 ° C で攪拌しながら 0.1 M 酢酸緩衝液 1 リットルに浸してすべての 12 h × 2 バッファーを交換し、内因性 3 NT および亜硝酸 (2-) を除去するために夜間透析を行います。透析後ソリューションを収集し、ビシンコニン酸 (BCA) 蛋白質の試金によってタンパク質の濃度を測定します。 プリフィルターまたはバックアップ フィルターから 6 mm の丸い円をパンチ、マイクロ チューブに入れてください。最大 6 mm の分数の 5 個は、分析 (図 2) を使用できます。 0.1 M 酢酸緩衝液 50 μ g のカクテル非特異的なプロテアーゼのタンパク質 (1.2.1 の手順で準備) 回転 16 h 50 ° C で午後蛋白質を加水分解管を含む 300 μ L を追加します。注: 内因性を減算するには、非特異的なプロテアーゼ カクテル ソリューションから 3 NT 必要がある準備し、非特異的なプロテアーゼのカクテルのみのサンプルをダイジェストに 0.1 M 酢酸緩衝液を追加し、遠心分離によって、供給管と限外ろ過膜をリンス (30 秒; 10,000 x g 正確な速度は膜に依存)、膜の 3 NT と同様の化学物質の汚染のため。繰り 1 x。 後分解限外ろ過膜に 2,500 x g で 10 分間負荷上澄みでサンプルを遠心し、10,000 x g と限外ろ過のための 4 ° C で遠心分離機 (MWCO = 10,000)、十分な溶出量が収集されるまで。暗闇に 4 ° C で溶出を格納します。注意: スピン欄 3 NT に類似したピークの検出、原因必要だ HPLC 水などバッファーと事前 0.1 M 酢酸緩衝を使用する、きれいな水でよく洗浄します。 2. 電気化学検出高速液体クロマトグラフィー ECD) システムと午後7を介して高速液体クロマトグラフィー PM2.5、小さじ 3 NT の定量 注: は、図 3を参照してください。 移動相を準備します。 0.2 M リン酸緩衝液 (2.5) 含む 50 mg/L EDTA を準備します。バッファーの 98 ボリュームとアセトニ トリル (HPLC 級) の 2 つのボリュームを測定、きれいなガラス瓶にそれらを注ぐ、キャップと精力的にミックスします。 溶存空気がきっかりまで数時間室温で移動相を解決します。注: 場合は、システムを起動する前、移動相超音波処理でき真空下で脱泡します。ただし、過度の脱気水と蒸発による有機相の比率が変更されます。 HPLC-ECD システムはポンプ、HPLC カラム、脱ガス装置、ECD、インジェクターから成っています。移動相の平衡し、背景成分やノイズを低減し、システムを安定させます。 高速液体クロマトグラフィーにおける HPLC カラムと移動相をインストールします。高速液体クロマトグラフィー ポンプをオンにし、開始日の前日から 25 ° C カラム温度で 500 μ L/分の流量で移動相を持つ列を安定させます。 次の日、ECD を発火し、パラメーターを設定 (-900 で還元電圧 mV と励起電圧 400 mV)。少なくとも 3 時間それを安定させます。 午後73 NT 濃度を測定します。 0.1 M 酢酸緩衝液で 3 NT 基準 (5-500 nM) と空白の様々 な濃度 (なし 3 NT の標準および非特異的カクテル、バイアルもバッファーを確認するプロテアーゼが汚染されている) を準備します。 高速液体クロマトグラフィー データ プロセッサを実行します。 25 μ L を注入量自動注射器とセットでサンプル瓶を置く移動相の流量ステップ 2.2.1 で述べたように同じ条件を動作します。注: サンプルの準備が完了したら場合、必要がありますサンプル、標準 (5-500 nM)、非特異的なプロテアーゼのカクテルのみのサンプルおよび空バイアル。 クロマト グラムのベースラインがフラットであることを確認し、サンプル注入を開始します。注: 一般に、3 NT が検出された 20 21 分;ただし、サンプル注入あたりの実行時間としては、約 30 分の使用をお勧めします。それ以外の場合、次の実行の汚染ピーク表示されます。 3. クロマト グラム及び午後7 3 NT コンテンツの定量化の分析 クロマト グラムで 3 NT ピークを確認し、内容を計算します。 データ収集後解析ソフトウェアでクロマト グラム データ ファイルを開きます。 3 NT ピーク平坦な基線から線を描くし、線からピーク高さを読み取る。注: 定量限界は約 5 nM (25 μ L 注入の 125 fmol)。注意: は、ECD の電極を徐々 に使い尽くすし、限界は S/N 比のため高くなります。 3 NT 標準ピークから回帰直線を準備、計算、斜面とインターセプトします。 以下の式にこれらの定数を割り当て、3 NT 含有試料を次のように計算します。サンプル 3-NT (nM) = [サンプル ピーク-インターセプト] ・斜面, 式 (1)注: 標準的なカーブ、よくとして表現されます 5 間の直線 nM と 500 nM。 空気環境でサンプル バイアルから午後7 3 NT を計算します。 反応体積 (と希釈因子であれば)、3 NT 濃度を乗算し、午後7円から絶対 3 NT コンテンツを評価します。 収集したフィルター区域を測定し、合計午後 3 NT コンテンツを計算する次式により7フィルター。合計午後7 = [円の午後7 3 NT 内容] × [サークル周辺午後7フィルター領域の比率] (モグラをグラムに変換する) 場合 226.19 x 式 (2) 総風量または PM 総午後7で割って空気環境または午後7 3 NT コンテンツを評価7重量 (1.1.3 のステップで記録されて)。