Bewertung von zellulären Stresses und Entzündung im diskreten Oxytocin-sezernierenden Gehirn Kerne bei Neugeborenen Ratten vor und nach der ersten Fütterung Kolostrum

Im Gegensatz zu unserem Verständnis der frühen Entwicklung des Gehirns im Laufe von Tagen bis Wochen nach der Geburt auftreten, ist relativ wenig über die Vielzahl von dynamischen Veränderungen in den ersten Stunden des Lebens in Ratten bekannt. Eine zentrale Herausforderung wurde die geringe Größe des Gehirns neonatalen Ratte und eine Voraussetzung für High-Tech-Werkzeuge, diskrete Hirnregionen oder einzelne Zellen zu isolieren. Studien beurteilen oft gen Transkription und keine Übersetzung^1,2, die kein festes Verständnis der funktionalen Ebenen der aktivierten Signalmoleküle geben. Andere untersuchen Ausdruck verwenden Immunohistochemistry, Referenz Hirnregionen, die für die Quantifizierung der Ausdruck Level³nicht zulässt. Keine Studie bis heute hat die Aktivierung der Signalwege verbunden mit Ratten erste Colostrum ernähren sich in diskreten Hirnregionen, die erfordert schnelle Isolierung und Opfer und Messung der Proteinexpression und Protein-Phosphorylierung mit westlichen untersucht beflecken. Während auf älteren und größeren Gehirn Gehirn Mikrodissektion durchgeführt wird, haben wir keinen Verweis durchführen einen Single-Cell Gehirn Schlag in einem P0 Gehirn identifiziert. Dieser Beitrag stellt ein Protokoll für die Isolierung von eingeschränkter Hirnregionen Neugeborenen mit einer relativ Low-Tech-Punch-Technik und ein Western-Blot-Verfahren zur Proteinexpression in relativ kleinen Proben zu messen. Dieses Protokoll möglicherweise geeignet für Forschungsfragen, die die Beurteilung der Proteinexpression und post-translationalen Modifikationen erfordern (z. B.., Phosphorylierung) in relativ begrenzten Regionen kleine Gehirne aller Arten, sofern die Benutzer kann die Hirnregion des Interesses mit Atlas und identifizierbaren Wahrzeichen optisch identifizieren.

Diese Technik wurde entwickelt, um Veränderungen im Gehirn durch die Neugeborenen Ratten erste Kolostrum zu füttern, die ist reich an Oxytocin (OT) zu verstehen. OT ist seit langem bekannt für seine Fähigkeit, Milch Milchspendereflex und uterine Kontraktion zu stimulieren. OT ist jedoch jetzt bekannt, um eine Vielzahl von Rollen spielen bei der Regulation vieler Körperfunktionen und Verhaltensweisen⁴. Z. B. OT wendet sich gegen Stress und Entzündungen in Verbindung mit adaptive affiliative Verhaltensweisen⁵, verzögert die Magenentleerung und verlangsamt die Darmpassage. OT-Rezeptoren (OTR) wurden im enterischen Neuronen und Darmepithel^6,7,8nachgewiesen. Die Magen-Darm-Wirkungen der OT sind besonders wichtig für das Kind während der frühen postnatalen Periode. Zum Beispiel stillen ist verbunden mit der Lieferung von erheblichen Mengen von OT zu den Neugeborenen Darm^9,10, und Daten zeigen, dass die OTR während die Milch, die Periode⁸Spanferkel im Zwölffingerdarm Zotten stark überexprimiert ist.

In-vitro- Experimente mit einer Darm-Zelllinie haben auf zellulärer Ebene unter Beweis gestellt, dass Oxytocin moduliert wichtiger Moleküle in den Stress Weg^11,12 -Signalisierung und spielt eine regulierende Rolle in der Übersetzung von Proteinen ¹². diese Studien deuten darauf hin, dass Bestandteile der Milch, einschließlich exogener Oxytocin von der Mutter in unfolded Protein Response beim Neugeborenen zu zellulären Stresses¹³wichtig sind.

In Vivo und ex Vivo -Studien haben gezeigt, dass Kolostrum OT die zellulären Stress Response, Entzündung und Autophagie Marker in Neugeborene Ratte Darmzotten moduliert. Neugeborenen Enterozyten erleiden erhebliche zellulären Stresses auf ihrer luminalen Seite wenn Darm Microbiota gleichzeitig von der Mutter in Kolostrum^14,15 und zahlreichen Proteinen, einschließlich der Hormone wie OT⁹ ausgesetzt ist ^{, 10 , 16}.

Die Auswirkungen der OT auf das Gehirn wurden studierte¹⁷. Die OT Signalisierung Mechanismen im Darm während der frühen postnatalen Periode nachgewiesen wurden jedoch nicht im Gehirn untersucht. In diesem Papier wird eine Methode zur Isolierung von diskreten Gehirn Kerne in der neonatalen Ratte Hirnstamm und Hypothalamus mit Elektrophorese verwendet, isolierte Hirnregionen zu profilieren. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, den Zustand der Zelle signalisieren in Hirnareale so nah wie möglich an Geburt, vor und nach der ersten Milch saugen, im Hirngewebe mit dem niedrigsten Glia/neuronale Index zu erfassen. Die Gründe für die Entwicklung dieser Technik ist, dass es für die schnelle Lokalisierung der eingeschränkt, mikroskopische Gehirnregionen bei neugeborenen Welpen mit einer homogeneren Sammlung von Neuronen für ex-Vivo -Studien mit einer automatisierten Western blotting Methodik, bietet sehr konsistente Ergebnisse auf relativ kleine seziert Proben. Ein Manko der vorherige Arbeit beinhaltet mehr Brutto Dissektion (Gehirnscheiben oder ganze Gehirn) und ältere Tiere^18,19. Die Gehirne von jungen Welpen sind unglaublich dynamisch, mit Wellen von Gliazellen Differenzierung nach der Geburt. Um Veränderungen im Gehirn beeinflusst durch der Welpen erste Fütterung zu studieren, ist das Studium beschränkt neuronalen Kerne mit reproduzierbaren Dissektion notwendig.

Milch-Feed wird in der Regel für ihre Ernährungs- und immunologische Auswirkungen auf Gesundheit oder gen-Ausdruck (z. B. im Enterozyten^20,21), analysiert, während seine Wirkung auf Hirnareale während der Entwicklung des Gehirns ist kaum untersucht. Die Wirkung der Milch Transit im Darm auf die Gehirnfunktion wurde in Anlehnung an Darm Cholecystokinin Rezeptoren vagalen Relais Hirnstamm Kerne, aber nicht auf intrazelluläre Signal-Wege²²analysiert. Gibt es eine umfangreiche Literatur auf das sich entwickelnde Gehirn Neugeborene Anfälligkeit für Unterernährung der Mütter während der Schwangerschaft²³, aber der Stress und Entzündungen Signale werden nicht angesprochen. Die aktuelle Methode nutzt vor allem ein Phänomen bei Tag Null Ratte Neugeborenen, das Blut geboren Kolostrum Reize von vagalen Relais des viszeralen Reize isoliert. Dies ist die so genannte Hypo-Reaktionsfähigkeit Stressphase geprägt von unreifen Nucleus Gowersbündel Solitarius (NTS)-Hypothalamus Schaltung unmittelbar nach der Geburt^24,25 , die NTS, paraventrikulären Nukleus (PVN), einschränkt und supraoptischen Kern (Sohn) Signale auf Blut geboren Reize.

Diese Methode ist nützlich für die Analyse von mehreren Signalwege und relativ auf neuronalen Zellen beschränkt, sofern Hirngewebe bei postnatalen Tag-0 bei Ratten geerntet wird, neben ob Mütter in Frage gestellt haben, indem Sie jede Art von Behandlung während der Schwangerschaft. Würfe können für die Wirkungen von Kolostrum feed versus Pre füttern Signalisierung analysiert werden. Beim Vergleich von Signalen zwischen den Hirnarealen mit Armen im Vergleich zu reiche Proteinausbeute ermöglicht diese Methode in der Kapillare Bestimmung des Gesamt-Protein der Polypeptid-Bands in Kapillaren, die parallel zur immun-Quantifizierung der Protein-Antigene. Diese Methode ermöglicht den quantitativen Vergleich, mit willkürlichen Maßeinheiten, Ergebnisse, die durch die gleichen Antikörper ohne quantitative Standardkurven und unter Bezugnahme auf Gesamt-Protein pro Kapillare. Vergleich der Ergebnisse von verschiedenen Antikörpern ist möglich nur mit quantitativen standard Kurven.

Diese Methode erlaubt für die Beurteilung der bidirektionalen Signaltechnik zwischen Darm und Gehirn und dass Funktion in beiden Organen²⁶auswirken kann. Die Zuordnung zwischen Oxytocin und Nahrungsaufnahme, die in den letzten Jahren²⁷ausführlich studiert hat, unterstützt einen Zusammenhang zwischen erhöhten Oxytocin Signal- und Nährstoffverfügbarkeit. Diese Studien auch unterstützen das Converse-Konzept diese Energie, die Defizite mit Reduzierung des Hypothalamus Oxytocin Signalisierung gekoppelt sind.

Frühere Studien über die Wirkung von OT auf Aktivität des Gehirns gezeigt, dass induzierte Darm Entzündung cFos Transkription im Hypothalamus PVN, Amygdala und Piriform Rinde löste die refraktär gegenüber Vagotomie²⁸war. Systemische Infusion von OT mit Sekretin sank jedoch die Gehirn cFos Reaktion provoziert entzündliche Reaktion in der Darm-²⁸. Dies suggeriert, dass die Wirkung von exogenen OT durch Strecken außer vagalen Relais, möglicherweise durch Blut übertragbare Signalmoleküle, durchgeführt durch die Area Postrema^6,29durchgeführt wurde.

In dieser Studie wurden die zellulären Stresses Signalwege, die zuvor im Darm beobachtet haben im Gehirn bewertet. Die Hypothese war, dass Milchbestandteile können zu schützen oder die Wirkung von Entzündungen im Darm Durchlässigkeit für mikrobielle und andere Metaboliten zu verschieben, und wiederum, die Auswirkungen auf die Gehirnfunktion. Die klare antagonistischen Unterschiede in der IkB versus BiP Signalisierung gefunden in Zotten, vor und nach dem Grundieren von Kolostrum¹³, vorgeschlagen, dass die Gehirne von Neugeborenen, noch in der Entwicklung, diese Signale Kolostrum-induzierte Darm spüren können.

Signalisierung Protein-Marker verwendet in früheren Darm-Experimente, die mit endoplasmatische Retikulum Stress verbunden sind, wurden gemessen. Dazu gehören das ER Chaperon BiP, Übersetzung Einleitung Faktor eIF2a (dient als eine Stress-Reaktion Integrator³⁰), eIF2a-Kinase p-PKR, und zwei Entzündung-Signalisierung Proteine (NF-kB und die IkB-Hemmer).

Sechs Regionen des Gehirns aufgrund ihrer Fähigkeit bei Erwachsenen absondern oder reagieren auf OT wurden ausgewählt. NTS, befindet sich in der oberen Medulla, ist das erste Relais der viszeralen Eingabe und erhält direkte Signalisierung von vagalen sensorischen Neuronen im Darm³¹ und möglicherweise Blut geboren Zytokine, Toxine und Hormone über die angrenzenden Bereich Postrema³². Der PVN supraoptischen Kern (Sohn), Striatum Kerne (STR), Großhirnrinde (CX) und mediale präoptischen Kern (MPO) erhalten aus dem Bauch heraus über die NTS-Signalisierung.

Ergebnisse zeigten, dass die zellulären Stress-Reaktion während der unmittelbaren postnatalen vor Kolostrum Grundierung und unmittelbar nach der ersten Fütterung in NTS im Vergleich zum PVN und Sohn unterscheidet. Signalisierung im CX, unterschieden sich STR und MPO PVN und Sohn, sowie. Die unterschiedlichen Schutzfunktionen der zuvor gezeigten Zelle Stress und Entzündungen im Darm zu modulieren OT sind wahrscheinlich durch einige Bereiche des Gehirns spürte. Kollektiv, zeigen die Daten, dass auf zellulärer Ebene, während der ersten Stunden nach der Geburt, das Gehirn zu den metabolischen Stress mit Nährstoff-Insuffizienz reagiert. Die Daten zeigen auch, dass das Ausmaß und die Richtung der modulierenden Wirkungen der feed Kolostrum Region-abhängig sind und in einigen Regionen sie OT Effekte im Darm zuvor gezeigten spiegeln.