Isolamento de F₁-ATPase do Protista parasita Trypanosoma brucei

Os F-tipo ATP sintases estão ligados a membrana rotativa complexos Multiproteicos translocação de prótons que casal entre energia-transducing membranas de cloroplastos, mitocôndrias e bactérias com a formação de ATP. Detalhes moleculares do mecanismo rotacional da síntese de ATP são conhecidos principalmente por causa de estudos estruturais de purificado bacteriana e mitochondrial ATP sintases e seus subcomplexes¹. F-tipo ATP sintase está organizado em partes da membrana-intrínsecos e extrínsecos-membrana. A parte da membrana-extrínseco, conhecida como F₁-ATPase, contém três sites catalíticos, onde ocorre a fosforilação de difosfato de adenosina (ADP) para ATP ou a reação inversa. F₁-ATPase pode ser libertada experimentalmente o moiety intrínsecas da membrana mantendo sua capacidade de hidrolisar, mas não sintetizar, ATP. O setor de membrana-limite, chamado F_ó, Medeia a translocação da proteína, que leva a rotação da parte central da enzima. Os setores de_ó de F e F₁ são conectados pelos talos centrais e periféricos.

O primeiro tenta purificar o F₁-ATPase do fermento de brotamento e coração bovinos mitocôndrias data voltar à década de 1960. Estes protocolos usados extraído de mitocôndrias, que foram interrompidas pelo sonication, fracionado por precipitação de sulfato de amônio ou protamina, seguida da execução opcional cromatografia e tratamento térmico^{2,3,4 ,5,6}. A purificação foi grandemente melhorada e simplificada pelo uso de clorofórmio, que prontamente libera o F₁-ATPase da membrana mitocondrial fragmentos⁷. A extração de clorofórmio foi então usada para extrair F₁– ATPase de vários animal, vegetal e bacterianas fontes (por exemplo, fígado de ratos⁸, milho⁹, Arum maculatum¹⁰e Escherichia coli ¹¹). Mais purificação do clorofórmio-lançado F₁-ATPase por cromatografia de afinidade ou tamanho-exclusão (SEC) rendeu uma proteína altamente pura complexa, que era adequada para a determinação da estrutura de alta resolução por cristalografia de raios x, como documentado pelas estruturas de F₁-ATPase de coração bovino^12,13 e Saccharomyces cerevisiae¹⁴. F₁-estruturas de ATPase determinaram-se também de organismos que são difíceis de cultivar e, assim, a quantidade de matéria biológica inicial foi limitada. Neste caso, a F-₁-subunidades ATPase foram artificialmente expressa e montados para o complexo em e. coli, e a enzima heteróloga toda foi purificada por afinidade cromatografia através de uma subunidade marcada. Tal abordagem levou à determinação de F₁-estruturas de ATPase de duas espécies de bactérias termofílicas, Geobacillus stearothermophilus¹⁵ e Caldalkalibacillus thermarum^{16, 17}. no entanto, esta metodologia é bastante inadequada para eucariontes F₁– ATPase desde que baseia-se no aparelho protheosynthetic procarióticas, processamento pós-traducional e montagem complexa.

A extração baseado em clorofórmio foi usada anteriormente para isolar F₁– ATPase de digenetic unicelulares parasitas Trypanosoma cruzi¹⁸ e T. brucei¹⁹, importantes patógenos mamíferos causando americano e Trypanosomiases africanos, respectivamente e de monogénicas inseto parasita Crithidia fasciculata²⁰. Estas purificações levaram apenas para uma simples descrição do F₁– ATPase, desde que não há aplicações a jusante foram usadas para caracterizar plenamente a composição, estrutura e propriedades enzimáticas do complexo. Este artigo descreve um método otimizado para F₁-purificação ATPase desde a fase do ciclo de vida de inseto culta de T. brucei. O método é desenvolvido com base em protocolos estabelecidos para isolamento de bovinos e levedura F₁– ATPase^21,22. O procedimento produz altamente pura e homogênea enzima apropriada para em vitro enzimática e inibitórios ensaios, caracterização detalhada proteomic por espectrometria de massa²³e de determinação de estrutura²⁴. O protocolo de purificação e o conhecimento da F₁-estrutura ATPase do nível atômico abre uma possibilidade para a concepção de telas para identificar inibidores da pequeno-molécula e ajuda no desenvolvimento de novas drogas contra trypanosomiases africanos. Além disso, o protocolo pode ser adaptado para purificar F₁-ATPase de outros organismos.