Isolatie van F₁-ATPase van de parasitaire Protist Trypanosoma brucei

De F-type ATP synthases zijn membraan-gebonden roterende multiprotein complexen die paar proton translocatie over energie-transducing membranen van bacteriën, mitochondria en chloroplasten met de vorming van ATP. Moleculaire gegevens van het roterende mechanisme van de ATP-synthese bekend zijn voornamelijk vanwege structurele studies van gezuiverde bacteriële en mitochondriale ATP synthases en hun subcomplexes¹. F-type ATP-synthase is onderverdeeld in de membraan-intrinsieke en extrinsieke membraan wordt. Het membraan-extrinsieke deel, bekend als F₁-ATPase, bevat drie katalytische sites, waar de fosforylatie van adenosinedifosfaat (ADP) naar ATP of de omgekeerde reactie optreedt. F₁-ATPase kan worden vrijgegeven experimenteel van de membraan-intrinsieke groep met behoud van haar vermogen om te hydrolyseren, maar niet synthetiseren, ATP. De sector van de membraan-gebonden, genaamd F_o, bemiddelt eiwit translocatie, die de rotatie van het centrale deel van het enzym drijft. De F-₁ en F_o sectoren zijn verbonden door de centrale en perifere stengels.

De eerste pogingen om te zuiveren van de F-₁-ATPase van ontluikende gist en boviene hart mitochondriën datum terug naar de jaren 1960. Deze protocollen gebruikt geëxtraheerd mitochondriën, die werden verstoord door ultrasoonapparaat, gespreide door ammonium of tijdje sulfaat neerslag, gevolgd door een optionele chromatografie stappen en warmtebehandeling^{2,3,4 ,5,6}. De zuivering is sterk verbeterd en vereenvoudigd door het gebruik van chloroform, die gemakkelijk de versies van de F-₁-ATPase van de mitochondriale membraan fragmenten⁷. De chloroform winning werd vervolgens gebruikt om te uittreksel van F₁– ATPasen van diverse dier, plant en bacteriële bronnen (bijvoorbeeld, rat lever⁸, maïs⁹, Gevlekte aronskelk¹⁰tr Escherichia coli ¹¹). Verdere zuivering van de chloroform-vrijgegeven F₁-ATPase door affiniteit of grootte-uitsluiting chromatography (SEC) leverde een zeer zuivere eiwit complex, die geschikt voor hoge resolutie structuurbepaling door middel van röntgendiffractie was, als gedocumenteerd door de structuren van F₁-ATPase van boviene hart^12,13 tr¹⁴van de Saccharomyces cerevisiae. F₁-ATPase structuren werden ook bepaald op basis van organismen die moeilijk te cultiveren en, dus, het bedrag van het eerste biologisch materiaal was beperkt. In dit geval, de F-₁-ATPase subeenheden kunstmatig werden uitgedrukt en samengevoegd tot het complex in E. coli, en het hele heterologe enzym werd gezuiverd door affiniteit chromatografie via een gecodeerde subeenheid. Dergelijke aanpak heeft geleid tot de vaststelling van F₁-ATPase structuren uit twee thermofiele bacteriesoorten, Geobacillus stearothermophilus¹⁵ tr Caldalkalibacillus thermarum^{16, 17}. deze methode is echter nogal ongeschikt voor eukaryotische F₁– ATPasen aangezien zij beroept zich op de prokaryote protheosynthetic toestellen, posttranslationele verwerking en complexe assemblage.

De winning van chloroform gebaseerde werd eerder gebruikt om te isoleren F₁– ATPasen van digenetic van eencellige parasieten Trypanosoma cruzi¹⁸ tr T. brucei¹⁹, belangrijke zoogdieren ziekteverwekkers, waardoor Amerikaanse en Afrikaanse trypanosomiasen, respectievelijk, en van monogeen insect-parasiet Crithidia fasciculata²⁰. Deze zuivering leidde slechts tot een eenvoudige beschrijving van de F-₁– ATPasen, aangezien geen downstream toepassingen werden gebruikt om de samenstelling, structuur en enzymatische eigenschappen van het complex volledig te karakteriseren. Dit artikel beschrijft een geoptimaliseerde methode voor F₁-ATPase zuivering van de fase van de levenscyclus van de gekweekte insecten van T. brucei. De methode is ontwikkeld op basis van de vastgestelde protocollen voor isolatie van runderen en gist F₁– ATPasen^21,22. De procedure levert zeer zuiver en homogene enzym geschikt voor in vitro enzymatische en remmende testen, gedetailleerde proteomic karakterisering door massaspectrometrie²³en structuur vastberadenheid²⁴. Het protocol van de reiniging en de kennis van de F-₁-ATPase structuur op het atomaire niveau opent een mogelijkheid voor het ontwerpen van de schermen te identificeren kleine-molecuul remmers, steun bij de ontwikkeling van nieuwe medicijnen tegen Afrikaanse trypanosomiasen. Bovendien, het protocol kan worden aangepast aan het zuiveren van F₁-ATPase van andere organismen.