该方案描述了从锥虫培养阶段的 f1-atpase 的纯化.该程序产生了高度纯、均匀和活性的复合物, 适用于结构和酶学研究。
f1-atpase 是 f 型 atp 合成酶的膜外催化亚基, 是利用质子动力穿过生物膜产生三磷酸腺苷 (atp) 的酶.将完整的 f1-atpase 从其原生来源中分离出来是表征酶蛋白质组成、动力学参数和对抑制剂敏感性的必要前提.一种高度纯和均匀的f-1 atpase可用于结构研究, 从而深入了解 atp 合成和水解的分子机制。本文介绍了一种纯化非洲锥虫酶病原体—– ———————————————————————————————————f 1-atpase 从线粒体囊泡中分离出来, 线粒体囊泡是通过体外培养的锥体细胞的低渗裂解获得的.囊泡通过超声进行机械分裂, f1-atpase通过氯仿提取从线粒体内膜中释放。酶复合物通过连续阴离子交换和尺寸排除色谱进一步纯化。敏感质谱技术表明, 纯化后的复合物几乎没有任何蛋白质污染物, 因此是 x 射线晶体学或低温电子显微镜测定结构的合适材料。分离的f-1atpase 具有 atp 水解活性, 可通过 f 型 atp 合成酶的有效抑制剂–氮化钠完全抑制。在室温下, 纯化后的复合物保持稳定和活跃至少三天。硫酸铵沉淀用于长期储存。类似的程序已被用于纯化 f1-atpase 从哺乳动物和植物组织, 酵母, 或细菌.因此, 所提出的议定书可作为从其他生物体分离 f-1-atpase 的指南.
f 型 atp 合成物是膜结合旋转多蛋白复合物, 它将质子在细菌、线粒体和叶绿体的能量传递膜上的移位与 atp 的形成结合在一起。atp 合成旋转机理的分子细节之所以知道, 主要是因为对纯化的细菌和线粒体 atp 合成酶及其亚配合物进行了结构研究1。f 型 atp 合酶被组织成膜固有的和膜外的摩尔。膜外源部分, 称为 f1-atpase,包含三个催化位点, 其中磷酸化的二磷酸腺苷 (adp) atp 或反向反应发生。f1-atpase 可以从膜固有的因子中实验释放, 同时保持其水解但不合成 atp 的能力.膜结合区, 称为 fo,介导蛋白质易位, 这驱动了酶的中心部分的旋转。f1和 f o扇区由中心和外围秸秆连接。
第一次尝试净化 f1-atpase从发芽的酵母和牛心脏线粒体可以追溯到20世纪60年代。这些协议使用提取的线粒体, 通过超声分解, 由铵或硫酸丙胺沉淀分解, 然后进行可选的色谱步骤和热处理2,3,4 ,5,6。氯仿的使用大大改善和简化了纯化, 很容易从线粒体膜碎片7中释放出 f1-atpase.然后用氯仿提取, 从各种动物、植物和细菌来源 (如大鼠肝脏8、玉米 9、金银花10和大肠杆菌)中提取 f1-atpase 11)。通过亲和或大小排除色谱法(sec) 进一步纯化氯仿释放的 f1-atpase, 产生了一种高度纯的蛋白质复合物, 适用于 x 射线晶体学的高分辨率结构测定。记录了牛心脏 12、13 和酿酒酵母14 的 f1-atpase 的结构.f-1-atpase 结构也是由难以培养的生物确定的, 因此, 最初的生物材料的数量有限。在这种情况下, f1-atpase 亚基被人工表达并组装成大肠杆菌复合物, 整个异源酶通过带标记的亚基通过亲和层析纯化. 这种方法导致测定了两种嗜热细菌的 f1-atpase 结构, 即 15 型硬毛虫和热性钙弧菌16 . 17. 然而, 这种方法相当不适合真核细胞 f-1-atpases, 因为它依赖于原核合成装置、翻译后处理和复杂的组装。
以氯仿为基础的提取剂以前被用来从单细胞二基因寄生虫trypanosoma cruzi 18和t. brucei19中分离出 f-1-atpase, 这是引起美国和美国的重要哺乳动物病原体.非洲锥虫酶, 分别来自单源昆虫寄生虫刺五加 20。这些净化只导致对 f1-atpase 的简单描述, 因为没有使用下游应用来充分描述该综合体的组成、结构和酶特性。本文介绍了一种从t.brucei 的培养昆虫生命周期阶段进行 f1-atpase 纯化的优化方法.该方法是在建立了牛和酵母 f1-atpase21、22分离方案的基础上发展起来的。该程序产生了高度纯、均匀的酶, 适用于体外酶和抑制检测、质谱仪23 的详细蛋白质组学表征和结构测定 24。纯化协议和原子级 f1-atpase 结构的知识为设计屏幕以识别小分子抑制剂提供了可能性, 并有助于开发抗非洲锥虫酶的新药.此外, 该协议还可用于从其他生物中净化 f 1-atpase。
在先前公布的从其他13、 14 种分离f1-atpase 复合物的方法基础上, 制定了 t. brucei 的f1-atpase 纯化方案.该方法不需要任何基因改造 (例如标记), 并产生一个完全活跃的复合体, 所有亚基都存在。关键的一步是氯仿促进的释放的 f1-atpase 从酶的膜连接部分.在对目前所描述的所有真核物种的纯化中, 释放的亚复合体在 1:3: 1:1:…
The authors have nothing to disclose.
这项工作由教育部 erc cz 赠款 ll久、捷克共和国赠款机构18-17529s 和 erdf/esf 寄生虫致病性和毒性研究项目中心资助 (否)。CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759)。
Chemicals | |||
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP) | Applichem | A0948 | |
Amastatin Hydrochloride | Glantham Life Sciences | GA1330 | |
Aminocaproic Acid | Applichem | A2266 | |
BCA Protein Assay Kit | ThermoFischer Scientific/Pierce | 23225 | |
Benzamidine Hydrochloride | Calbiochem | 199001 | |
Bestatin Hydrochloride | Sigma Aldrich/Merck | B8385 | |
Chloroform | Any supplier | ||
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free | Roche | 4693159001 | Protease inhibitor cocktail tablets |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any supplier | ||
Hydrochloric Acid | Any supplier | For pH adjustment | |
Ile-Pro-Ile | Sigma Aldrich/Merck | I9759 | Alias Diprotin A |
Leupeptin | Sigma Aldrich/Merck | L2884 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate | Any supplier | ||
Pepstatin A | Sigma Aldrich/Merck | P5318 | |
Protein Electrophoresis System | Any supplier | ||
Sodium Chloride | Any supplier | ||
Sucrose | Any supplier | ||
Tris | Any supplier | ||
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Consumables | |||
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer | Beckman Coulture | 328874 | |
DounceTissues Homogenizer 2 mL | Any supplier | ||
Glass Vacuum Filtration Device | Sartorius | 516-7017 | Degasing solutions for liquid chromatography |
HiTrap Q HP, 5 mL | GE Healthcare Life Sciences | 17115401 | Anion exchange chromatography column |
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm | Sartorius | 18406–47——N | Degasing solutions for liquid chromatography |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 29091596 | Size-exclusion chromatography column |
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES | Sartorius | VS0641 | |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Equipment | |||
AKTA Pure 25 | GE Healthcare Life Sciences | 29018224 | Or similar FPLC system |
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601 | Shimadzu | Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode | |
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor | Beckman Coulture | Or similar ultracentrifuge and rotor | |
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000 | BioLogics | 0-127-0001 | Or similar ultrasonic homogenizer |