Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Shino Mitsunaga; Keiko Shioda; Kurt J. Isselbacher; Jacob H. Hanna; Toshi Shioda

doi:10.3791/58297

JoVE Journal > Developmental Biology

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Gelişim Biyolojisi

액 pluripotency에서 Embryoid 몸의 표면에 인간의 원시 생식 세포와 같은 세포의 생성 유도 만능 줄기 세포

Published: January 11, 2019

doi:

10.3791/58297

Shino Mitsunaga¹, Keiko Shioda¹, Kurt J. Isselbacher¹, Jacob H. Hanna², Toshi Shioda¹

¹Center for Cancer Research,Massachusetts General Hospital, ²Department of Molecular Genetics,Weizmann Institute of Science

Özet

원시 생식 세포 (PGCs)는 정자와 모두의 일반적인 선구자. 인간의 배아 PGCs cytokines의 상호 작용을 통해 만능 epiblast 셀에서 지정 됩니다. 여기, 우리가 유도 액 pluripotency 유도 만능 줄기 세포에서 embryoid 몸 표면에 PGCs을 닮은 인간의 세포 transcriptomally의 13 일 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

원시 생식 세포 (PGCs)는 모든 생식 세포의 일반적인 선구자. 마우스 배아에서 40 ~ PGCs의 창립 인구는 만능 epiblast 세포에서 cytokines, 뼈 morphogenetic 단백질 4 (Bmp4)를 포함 하 여 조율 된 노출에 의해 유발 됩니다. 인간 배아, 초기 PGCs 임신, 3^rd 주 말께 른 골목의 endodermal 벽에 확인 되었습니다 하지만 작은 인간의 PGC 사양 및 그들의 초기 발달의 과정에 대 한 알려져 있다. 인간의 배아 PGCs의 기술 및 윤리적인 장벽을 우회 하 대리 셀 문화 모델 최근 pluripotent 줄기 세포에서 생성 된 것. 여기, 우리 인간의 PGC-Like 셀 (hPGCLCs)의 강력한 생산에 대 한 일 프로토콜을 설명합니다. 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs) 끝났다 pluripotency 상태에서 유지 재프로그래밍 매체 48 시간에 대 한 4i 순진한에 인 큐베이 팅, 단일 셀에 해리 있으며 microwells로 포장. 순진한 pluripotency 상태에서 hiPSCs의 장시간된 유지 보수 중요 한 염색체 착오 원인과 피해 야 한다. hiPSCs는 microwells에 추가 4i 매체 형태 embryoid 시체 (EBs), 그는에 있는 24 시간 배양 낮은 준수 plasticware의 높은 농도 포함 하는 hPGCLC 유도 매체에 락 조건에 대 한 유지 됩니다. 재조합 인간 BMP4입니다. HPGCLCs의 최대 수율을 얻기 위해 락, 비 부착 상태에서 최대 8 일 동안 EBs 교양 추가. Immunohistochemistry로 hPGCLCs 그들의 표면에 독점적으로 거의 모든 EBs에서 OCT4를 강하게 표현 하는 세포로 쉽게 검색 됩니다. HPGCLCs CD38 + 셀 최대 40-45%으로 수집 될 수 있습니다 때 EBs는 효소 해리 FACS 농축을 복종, 항복.

Introduction

원시 생식 세포 (PGCs)는 남녀 모두에서 모든 생식 세포의 일반적인 선구자. 포유류 배아에 PGCs의 개발에 우리의 지식의 대부분이 실험실 쥐¹^,²공부를 통해 얻은 되었습니다. 마우스 배아의 배아 하루 6.0-6.5, 6 또는 유사한 PGC 선구자의 작은 숫자 epiblast, 그리고 창립 ~ 40 PGCs 방식으로 뼈 morphogenetic 단백질 Bmp2, Bmp4 인접에서 분 비에 의존 그들 로부터 유도 된다 인구에 있는 셀입니다. 배아에서 지금까지 확인 된 가장 이른 인간 PGCs 임신³의 제 3의 주에의 끝 주위에 노 른 자 골목의 endodermal 벽에 있었다. 이것이 같은 장소 마이그레이션 PGCs 마우스 배아에서 관찰 된다, 때문에 그것은 가능성이 관찰된 인간의 PGCs 마이그레이션 하지 창립 인구의 경로에 있었다. 그러나, 이전 단계를 다시 추적 연구 PGCs 또는 PGC의 인간 배아에서 일어나 누락 되었습니다.

인간의 배아 PGCs에 대 한 액세스 기술 및 윤리적인 장애 때문에 도전 이다. 이러한 장애물을 극복 하기 위해 PGC 같은 셀 문화 모델 최근 인간 만능 줄기 세포 (PSCs)에서 생성 된 것. Pluripotency는 생식 및 3 개의 미 발달 세균 층⁴으로 차별화 하는 세포질 기능입니다. 반면 인간의 Psc mTeSR1 매체 (준비–사용, 상업적으로 이용 가능한 매체 끝났다 pluripotency 상태에서 인간의 Psc의 유지 보수에 대 한 구상)에 세포 외 기질 단백질으로 코팅 하는 요리에 유지는 액 상태 pluripotency ⁴, 2013 년에 야 곱 한 나의 실험실 보였다 끝났다 pluripotency 셀 ERK1/2, GSK3, 설립, 바위, PKC, 단백질 kinases에 화학 억제제를 포함 순진한 인간 줄기 세포 매체 (NHSM)에 노출 하 여 순진한 pluripotency 상태도 변환할 수 있습니다 및 p38 MAPK 뿐만 아니라 성장 요인 LIF, TGF, bFGF⁵. 순진한 pluripotency 인간의 Psc에서 2015 년에 나와 Azim Surani 이끄는 연구 그룹 PSCs⁶에서 인간 PGC-Like 셀 (hPGCLCs)의 첫 번째 강력한 생산 달성. 나중에, 우리를 포함 한 다른 여러 실험실 보고 약간 다른 프로토콜⁷^,⁸^,^,⁹¹⁰을 사용 하 여 Psc에서 hPGCLCs의 세대. 우리의 연구 제공 증거 (우리가 이전에 게시 연구¹⁰의 표 s 1에서 요약 된다)는 서로 다른 프로토콜을 사용 하 여 생성 하는 hPGCLCs transcriptomally¹⁰를 서로 비슷합니다. 사용할 수 있는 증거는 초기 단계의 인간 배아 PGCs 글로벌 epigenetic 삭제⁷ 또는 혈 마이그레이션¹⁰이전에 인간 PGCLCs의 유사를 지원합니다.

연구의 마우스 배아 PGCs, 마우스 PGCLCs, 및 인간 PGCLCs (하지만 유일한 인간 PGCs에 대 한 매우 제한 된 액세스) PGC의 분자 메커니즘 마우스와 인간¹^,⁶^{, 사이 크게 차이가 밝혀} ⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,^,¹⁴¹⁵^,¹⁶ ^,¹⁷. 예를 들어 마우스 배아에서 PGC 사양에 중요 한 역할을 담당 하는 Prdm14 보이지만 인간의 PGC 사양에서의 역할 제한¹^,¹⁵. 대조적으로, SOX17 EOMESODERMIN에 의해 유도이 녹음 방송 요인 것 마우스 PGC 사양¹⁵불가결 반면 PGC 사양⁶^,^,¹¹¹⁴, 필수적 이다. 연구 강하게 hPGCLCs를 사용 하 여 이러한 초기 성과 인간의 배아 PGCs의 대리로 서이 세포 문화 모델의 중요성을 지원 합니다.

최근에 출판 된, genomic DNA 복사 번호 분석, 실험실의 깊은 시퀀싱 평가 관련 연구 순진한 pluripotency 상태에 Psc의 장기 유지 보수 크게 염색체 불안정성의 위험을 증가 하 고 구조상 변칙입니다. 이 현상은 마우스¹⁸ 와 인간의¹⁹ Psc 관찰 되었다. 한 나/Surani에 의해 보고 된 원래 hPGCLC 생산 프로토콜 2 주⁶4i 순진한 pluripotency 매체에 유지 하는 인간의 Psc에 대 한 개발 되었다. 인간의 PSCs 및 PGCLCs의 정상적인 2 중 karyotype를 유지 하려면 우리는 인간의 PSCs 72 시간¹⁰,이 문서에 표시 됩니다에 대 한 4i 매체에 노출 되는 수정 된 프로토콜을 개발 했다. 인간의 Ipsc (hiPSCs)는 끝났다 pluripotency 상태 유지 됩니다. EB 형성 직전 세포는 인 큐베이 팅 4i 순진한 재활 매체 (수정된 NHSM 매체)에서 48 시간 동안. 셀 해리 그리고 4i 매체에 추가 24 시간 형태로 EBs microwells에 포장 됩니다. EBs는 hPGCLCs의 최대 수확량을 얻기 위해 최대 8 일 동안 아니 첨부 문화에 대 한 락 조건 하에서 재조합 인간 BMP4의 높은 농도 포함 하는 hPGCLC 유도 매체에 유지 됩니다. 8 일 EB 문화, 후 hPGCLCs 수 FACS에 의해 해리 EB 셀에서 절연 CD38 + 최대 40%까지 셀 FACS 정렬 가능한 단일 셀에 항복. 반면 다른 출판 방법⁷^,^,⁸⁹, 우리의 수정⁶, 전에 원래 프로토콜을 포함 하 여 일반적으로 생성 hPGCLCs 관련 없이 자발적으로 형성 된 셀 집계 지역화, 우리의 프로토콜에 의해 생산 하는 hPGCLC embryoid 몸 (EBs)의 표면에서 관찰 된다.

Protocol

1. 세포 배양 Primed Pluripotency 상태에서 hiPSCs의 세포 외 기질 단백질 코팅 접시의 준비 하룻밤 냉장고 또는 찬 룸에 얼음에 Matrigel (세포 외 기질 단백질)를 녹여 (실 온 또는 따뜻한 물 목욕을 사용 하 여 녹여 하지 않습니다). Aliquot 매트릭스 단백질 (~ 200 μ;는 약 수의 볼륨은 각 일괄 처리에 대 한 제조 업체에 의해 결정 하 고 유리병의 라벨에 표시 된) 살 균 낮은 바인딩 원심 분리기 관 또는 얼음에 셀 cryopreservation 튜브로. 그것은 세포 외 기질 단백질을 응고를 피하기 위해 분배 하는 동안 차가운 유지 하는 것이 중요입니다. -80 ° c.에 aliquots 저장 세포 외 기질 단백질으로 세포 문화 플라스틱 접시, 코트 25 mL로 한 약 수를 희석 차가운 DMEM/F12 및 3-10cm 요리 확산 (~ 8 mL/접시). 적어도 1 시간 동안 실 온에서 요리를 품 어. 코팅, 후 요리 Parafilm 사용 하 고 1 주까지 동안 실내 온도에 저장 밀봉 될 수 있다. 접종 액된 pluripotency hiPSCs의 바로 앞에서 중간 발음 매체 또는 인산 염 버퍼 칼슘/마그네슘-무료 식 염 수 [PBS(-)] 코팅 설거지 필요는 없습니다. HiPSC 문화 끝났다 pluripotency 상태에서 개시 15 mL 원심 분리기 튜브에 mTeSR1 매체의 10 mL를 2 µ L 50 mM Y27632의 [억제제로 관련 단백질 키 니 아 제 (바위)]를 추가 합니다. 고정 셀 주식 1 mL에서 한 10 cm 접시에 세포 배양을 시작 하 록 10 mL 억제제 보충 매체의 2 개의 관을 준비 합니다. Y27632 보충 매체를 사용 하 여 같은 날에. 5 분 동안 37 ° C 물 욕조에 prewarm Y27632 보충 매체.참고:이 프로토콜은 hiPSCs mTeSR1에 유지 잘 작동 합니다. HiPSCs는 변화와 인간의 PSC 성장을 지 원하는 다른 미디어에서 유지 될 때의 액 또는 순진한 pluripotency, hPGCLCs의 수확량 크게 다를 수 있습니다.참고: 완전 한 mTeSR1의 수명 4 ° C에서 2 주 및 6 개월 동안-20 ° C, 하지만 다시 냉동 성능 저하 원인입니다. 우리는 사용까지 40 mL aliquots-20 ° C에서 mTeSR1의 동결. 끝났다 pluripotency hiPSC 주식 (1 mL cryopreservation 매체에 106 셀 x 1.0-3.0) 냉동의 유리병을 녹여 37 ° C 물 목욕을 사용 하 여. 해빙의 완료 후 즉시 prewarmed Y27632 보충 매체의 한 튜브 (10 mL)에 유리병의 전체 콘텐츠를 전송할. 실내 온도, 300 x g에서 원심 분리기 세포 현 탁 액 8 분 상쾌한 삭제 하 고 10 mL와 펠 릿 셀 resuspend prewarmed Y27632 보충 다른 관에서. 균등 하 게 세포 외 기질 단백질 코팅 10 cm 접시에 세포 현 탁 액을 확산. 트라이-가스 CO2 인큐베이터를 (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2)에 있는 접시를 놓습니다. HiPSC 문화 낮은 산소 압력을 유지 합니다. 변경 매체 (Y27632 없이 mTeSR1) 매일. 바위 억제제 (Y27632) 단일 셀에 분리 후 즉시 hiPSC 생존을 위해 중요 하다. HiPSCs와 균등 하 게 분산 된 작은 집계로 세포 외 기질 단백질 코팅 표면에 고착 되 면 > 10% (이 일반적으로 접종 후 16 시간 이내 완료) confluency, Y27632는 불가결. Y27632 없이 해리 hiPSCs의 접종 후 너무 일찍 중간 변화는 거의 완전 한 세포 죽음을 발생할 수 있습니다. Passaging 액 pluripotency hiPSCs참고: 통로 효과적인 성장 지역 ~ 80%를 차지 하는 식민지 때 pluripotency hiPSCs을 끝났다. 올바른 뿌리고 절차 및 밀도 실험의 재현성에 대 한 중요 하다. 우리는 hPGCLC 유도의 효율성 크게 다르지 않다 hiPSC 문화 사이 언된 증권 (하나 또는 두 개의 구절을 포함) 또는 한 달 개시 후 6 일 본 (관련 > 10 구절). HPGCLC의 유도 효율성은 양적 평가 하지 비록 2 개월 이상 유지 하는 hiPSCs에서 성공적으로 수행 됩니다. 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 분리 효소 혼합물의 4 mL를가지고 고 5 분 동안 실내 온도에 equilibrate. Prewarm 10 mL PBS(-) 15 mL 원심 분리기에 대 한 튜브 > 물 욕조에 37 ° C에서 5 분. 15 mL 원심 분리기 튜브에서 10 mL mTeSR1 매체를 2 µ L 50 mm Y27632 (락 억제제)를 추가 합니다. 바위 억제제 보충 10 mL 매체의 2 개의 관을 준비 하 고 같은 날에 사용. 또 다른 15 mL 원심 분리기 튜브에 Y27632를 추가 하지 않고 5 mL mTeSR1를 가져가 라. 5 분 동안 37 ° C 물 욕조에 Y27632 + prewarm 매체.참고: 단계 1.3.3에서에서 준비 하는 모든 중간 aliquots Y27632를 포함할 수 있습니다. Prewarmed 10 mL PBS(-) 한번 10 cm 접시와 린스 세포에서 오래 된 중간 발음 PBS(-)을 삭제 하 고 접시에 분리 효소의 4 mL를 추가 합니다. CO2 인큐베이터에 접시를 놓고 (트라이-가스 화기 작동 하지만 필요 하지 않습니다) 셀 바닥에서 분리 될 때까지 ~ 4 분. 단일 세포 현 탁 액을 만들기 위해 아래로 부드럽게 피펫으로 세포. HiPSC 단일 셀 서 스 펜 션 (15 mL 튜브에 총 볼륨은 약 9 mL) Y27632 없이 5 mL 매체를 포함 하는 prewarmed 튜브 전송. 원심 분리기 세포 현 탁 액, 300 x g 8 분 동안 실내 온도에. 상쾌한 삭제 하 고 Y27632를 포함 하는 prewarmed 중간 매체의 10 mL와 펠 릿 셀 resuspend. 40 µ m 셀 스 트레이너를 사용 하 여 셀 집계를 제거 하 고 셀 밀도 Coulter 카운터를 사용 하 여 결정 합니다. 106 세포는 세포 외 기질 단백질 코팅 10 cm 접시 접종을 10 mL에 x 3.0 달성 하기 prewarmed Y27632 보충 매체와 세포 현 탁 액을 희석. 트라이-가스 CO2 인큐베이터를 (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2)에 접종된 접시를 놓습니다. 변경 매체 (Y27632 없이 mTeSR1) 매일. 2입니다. hPGCLCs 세대 참고: 10 cm 접시 (mTeSR1 매체, 기질 단백질 코팅)에 hiPSC 셀 ~ 80 %confluency (약 107 셀)에 도달 하면 다음 단계를 시작 합니다. 세포 외 기질 단백질 코팅 요리 (주 1)의 준비 얼음에 세포 외 기질 단백질의 한 약 수를 해 동 하 고 차가운 DMEM/F12 25 mL에 희석. 6 잘 플레이트 (1 mL/음)을 희석된 세포 외 기질 단백질을 분배. 한 약 수 24 웰 스 (4 판) 코트에 충분 하다. 적어도 1 시간 동안 실내 온도에 번호판을 품 어. 사용 하지 않는 코팅된 접시 봉인 고 1 주까지 동안 실내 온도에 저장 될 수 있습니다. 끝났다 pluripotency hiPSCs의 접종 직전 격판덮개에서 중간 발음 매체 또는 PBS(-) 코팅 설거지 필요는 없습니다. 세포 외 기질 단백질 코팅 접시 (1 일)으로 끝났다 pluripotency hiPSCs의 접종 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 분리 효소의 4 mL를가지고 고 5 분 동안 실내 온도에 equilibrate. Prewarm 10 mL PBS(-) 15 mL 원심 분리기에 대 한 튜브 > 물 욕조에 37 ° C에서 5 분. 35 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에 mTeSR1 매체를 7 µ L 50 mm Y27632 (락 억제제)를 추가 합니다. Y27632 보충 매체를 사용 하 여 같은 날에. 총 70 mL Y27632 보충 매체에 대 한 두 개의 튜브를 확인 하 고 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 매체를 prewarm. Prewarmed 10 mL PBS(-) 한번 10 cm 접시와 린스 세포에서 오래 된 중간 발음 PBS(-)을 삭제 하 고 접시에 셀 분리 효소의 4 mL를 추가 합니다. CO2 인큐베이터에 접시를 놓고 (트라이-가스 화기 작동 하지만 필요 하지 않습니다) 셀 바닥에서 분리 될 때까지 ~ 4 분. 단일 세포 현 탁 액을 만들기 위해 아래로 부드럽게 피펫으로 세포. HiPSC 단일 세포 현 탁 액 10 mL Y27632 보충 매체를 포함 하는 prewarmed 튜브 전송. 원심 분리기 세포 현 탁 액, 300 x g 8 분 동안 실내 온도에. 상쾌한 무시 하 고 10 mL prewarmed Y27632 보충 매체와 펠 릿 셀 resuspend. 세포 현 탁 액 셀 집계 Coulter 카운터를 사용 하 여 셀을 셀 스 트레이너 (40 µ m 기 공 크기)을 통해 필터링. HiPSC 단일 세포 현 탁 액 50 mL prewarmed Y27632 보충 매체에 106 셀 x 5.0을 희석. 2 mL 세포 현 탁 액 (105 셀 x 2.0)에 각 잘 코팅된 6 잘 플레이트 (4 판, 24 웰 스)의 예방 셀에 각 잘 고르게 배포 됩니다 있는지 확인 합니다. 세포 배양 배지는 트라이 가스 CO2 인큐베이터 (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2)에 배치 합니다.참고: inoculum 셀 밀도 각 분배 잘이 중요 합니다. 때문에 10 cm 요리에 hiPSCs의 접종은 다른 지역 보다 상당히 높은 세포 밀도 발생할 수 있습니다. HiPSCs 단일 셀의 셀 밀도 심지어 6 잘 플레이트와 더 쉽게 얻을 수 있습니다. 접종 후 24 시간에서 보통 (Y27632) 없이 2 mL/잘 mTeSR1으로 변경 합니다. 4i 순진한 (ERK-독립) 만능 세포 (3 일, 4 일)에 끝났다 pluripotency 상태 hiPSCs의 변환 50 mL 원심 분리기 튜브 (3 일, 4 일) 다음과 같이 4i 완전 한 순진한 pluripotency 매체 준비: 4i 기저 매체의 50 mL, 30 mM CHIR99021, 10 mM PD0325901, 20 mM BIRB796, 50 mM SP600125의 5 µ L의 5 µ L의 5 µ L의 5 µ L 그리고 50 m Y27632 m의 5 µ L.주: 냉장고에 하룻밤-80 ° C에서 녹여 4i 기저 매체를 저장 합니다. 즉시 사용 하기 전에 신선한 4i 완벽 한 매체를 준비 합니다. 4i 화학 물질 (CHIR, PD, BIRB, 및 SP)의 강한 빛에 노출을 하지 마십시오. 완전 한 4i를 저장 하지 마십시오 또는 하룻밤 냉동 4 ° C에서 중간 이상. 와 함께 15 분 변경 매체에 대 한 37 ° C 물에 따뜻한 50 mL 4i 완전 한 매체 접종 후 48 ~ 72 시간에서 4i 완전 한 매체 (2 mL/잘) prewarmed. 중간 변경의 정확한 타이밍은 높은 hPGCLC 수율 및 실험의 재현성을 달성 하기 위해 중요 합니다.참고: 4i hiPSC 문화의 밀도 높은이 조건 하에서 이며, 접종 후 48-72 시간에 confluent 될 하지만 이것은 정상입니다. EB 형성 microwell 플레이트 (주 5)를 사용 하 여 50 mL 50 mL 원심 분리기 튜브에서 4i 완벽 한 매체를 준비 하 고 사용 하기 전에 ~ 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 그것을 prewarm. 35 mL DMEM/F12 사용 하기 전에 ~ 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 50 mL 원심 분리기 튜브 prewarm Microwell 접시를 준비 Microwell 플레이트의 8 활성 우물에 5% (w/v) 필터 소독 Pluronic F-127 세제를 추가 (참조 테이블의 재료; 0.5 mL/음). 실내 온도에, 1000 x g, 5 분 공기 방울의 부재를 보장 하기 위해 거꾸로 현미경으로 검사 microwells microwell 격판덮개 원심 Microwells 세제로 코트를 실 온에서 30 분 동안 microwell 접시를 둡니다. Prewarmed DMEM/F12를 pipetting와 린스 웰 스 microwell 격판덮개의 우물에서 세제 솔루션을 삭제 (2 mL/음). 실내 온도에, 1000 x g 5 분 공기 방울의 부재를 보장 하기 위해 거꾸로 현미경으로 검사 microwells microwell 격판덮개 원심참고: 때 공기 방울은 여전히 관찰 microwells에, microwell 시트는 여전히 확고 하 게 우물의 바닥에 붙어 있으면 검사. Prewarmed DMEM/F12를 pipetting와 린스 웰 스 microwell 격판덮개의 우물에서 DMEM/F12 취소 (2 mL/음). 2.4.3.4 2.4.3.3-단계를 반복 합니다. Microwell 플레이트 (1 mL/음)의 씻어 서 우물에 4i 완벽 한 매체를 추가 합니다. 37 ° C 물 욕조에 나머지 4i 완벽 한 매체를 유지. 실내 온도에, 1000 x g 5 분 공기 방울의 부재를 보장 하기 위해 거꾸로 현미경으로 검사 microwells microwell 격판덮개 원심 4i hiPSCs의 접종까지 (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) 트라이 가스 인큐베이터에서 microwell 접시를 놓습니다. Microwell 격판덮개로 4i Ipsc의 접종 15 mL 원심 분리기 튜브에 세포 분리 효소의 13 mL를가지고 고 5 분 동안 실내 온도에 equilibrate. Prewarm 50 mL 50 mL 원심 분리기에서 PBS(-)에 대 한 튜브 > 물 욕조에 37 ° C에서 5 분. 순진한 hiPSC 세포 문화와 린스 셀의 한번 prewarmed 2 mL 24 우물에서 오래 된 매체를 발음/PBS(-)를 잘. PBS(-)을 삭제 하 고 0.5 mL/잘 분리 효소를 추가 합니다. 셀 바닥에서 분리 될 때까지 ~ 4 분 CO2 인큐베이터 (37 ° C)에서 세포 배양 배지를 놓습니다. 단일 세포 현 탁 액을 만들기 위해 아래로 부드럽게 피펫으로 세포. HiPSC 단일 셀 서 스 펜 션 prewarmed 20 mL 4i 완전 한 매체에 전송. 원심 분리기 세포 현 탁 액, 300 x g 8 분 동안 실내 온도에. 상쾌한 삭제 하 고 셀 펠 릿 5 mL prewarmed 4i 완전 한 매체와 resuspend. 세포 현 탁 액 셀 집계를 제거 하려면 셀 스 트레이너 (40 µ m 기 공 크기)을 통해 필터링. 3 번 1 mL prewarmed 4i 완전 한 매체와 셀 여과기를 세척. Coulter 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다. 9 mL prewarmed 4i 완전 한 매체에서 106 셀 x 27.0 32.4를 4i 순 hiPSCs의 단일 세포 현 탁 액을 희석. Note 그 4i 완전 한 매체 Y27632에 이미 포함 되어 있습니다. 트라이-가스 화기 (2.4.3.9)에서 8 4i 완전 한 매체의 1 mL를 포함 하는 microwell 접시를 가져가 라. 각 음에 1 mL 4i 순 hiPSC 서 스 펜 션 (3.0-3.6 x 106 셀/잘)을 접종. 이 셀 밀도 중요 합니다. 셀 부드럽게 pipetting으로 각 음에 고르게 배포 됩니다 있는지 확인 합니다. 실내 온도, 3 분 x 100g에 microwell 격판덮개 원심 트라이-가스 CO2 인큐베이터를 (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2)에서 microwell 접시를 놓습니다. Microwells에서 수송과 세포를 방해 하지 마십시오. 24 ~ 30 시간에 대 한 셀을 품 어. 야간 보육 (~ 16 시간) 꽉 EBs의 형성에 대 한 일반적으로 충분 하지 않습니다. 락 문화 (주 6)에 대 한 낮은 부착 판 EBs의 전송 (하루 6-13 일) 다음과 같이 50 mL 원심 분리기 튜브에 hPGCLC 완전 한 매체를 준비:20 mL hPGCLC 기저 매체, 4 μ 500 m m 2-Mercaptoethanol, 20 mg/mL L-아 스 코르 빈 산의 50 μ, 100 μ g/mL의 50 m m Y27632, 50 μ의 4 μ의 재조합 인간 BMP4, 500 μ g/mL의 4 μ 인간의 SCF, 250 μ g/mL 인간 EGF의 4 μ 그리고 250 μ g/mL의 8 μ 인간의 LIF.참고: 사용 하기 전에 즉시 신선한 hPGCLC 완전 한 매체를 준비 하 고 빛에 노출 하지 마십시오. 완전 한 hPGCLC를 저장 하지 마십시오 또는 하룻밤 냉동 4 ° C에서 중간 이상.참고: BMP4의 농도 매우 높습니다. 최적의 BMP4 농도 BMP4의 일괄 처리 간의 달라질 수 있습니다. BMP4의 로트 차이 hPGCLC 생산을 강력 하 게 영향을 미칩니다. 완전 한 hPGCLC 매체에 BMP4의 부재, hPGCLCs의 비중은 매우 낮은6입니다. 완전 한 hPGCLC 매체에 있는 다른 사이토카인의 중요성은 한 나/Surani6에 의해 설명 되었다.참고:이 프로토콜의 완전 한 hPGCLC 매체에 인간의 LIF의 최종 농도 100 ng/mL6,10. 우리를 포함 한 이전 출판된 연구에 사용 된 최종 LIF 농도 1 μ g/mL 이었다. 때 인간의 LIF 시 약의 특정 활동은 > 10000 단위/μ g (에 드50 < 0.1 ng/mL), 100 ng/mL LIF EBs에서 hPGCLC 생성을 지원 하기 위해 충분 하다. EBs를 전송 5 mL hPGCLC 기저 매체와 20 mL hPGCLC 완전 한 매체에 대 한 prewarm > 물 욕조에 37 ° C에서 5 분. 조심 스럽게 셀 스 트레이너를 폴 리 프로필 렌 50 mL 원뿔 튜브 위에 거꾸로 놓습니다. 피펫으로 microwell의 각 잘 접시 접시 microwells에서 EBs 분리를 매우 부드럽게. EBs에서 포함 되지 않은 셀을 제거 하려면 셀 스 트레이너를 통해 각의 모든 내용을 필터링 합니다. 씻어 EBs prewarmed hPGCLC 기저 매체의 1 mL와 함께 셀 여과기에 유지 부드럽게 세척 5 회 반복 한다. 씻어 EBs 지금 50 mL 원뿔 튜브 거꾸로-다운에는 스 트레이너의 막에는 그대로 유지 됩니다. 셀 스 트레이너는 일반적으로 새로운 관에 배치 되도록 셀 여과기에 신선한 50 mL 원뿔 튜브를 놓습니다. 다음 신속 하 게 새로운 튜브 셀 거르는 반전. 셀 스 트레이너와 튜브는 지금 정상적인 위치에 있으며 EBs 셀 스 트레이너의 막 아래. 셀 스 트레이너의 막 위에서 18 mL prewarmed hPGCLC 완전 한 매체를 추가 하 여 원뿔 튜브에 EBs를 수집 합니다. 따라서, 매체는 멤브레인을 통과 하 고 EBs 원심 분리기 튜브의 맨 아래 막의 더 낮은 측에 수집. 낮은-첨부 6-잘 접시 (3 mL/음)의 우물으로 ebs 판 정지 (37 ° C, 6.5% O2, 5% CO2) 트라이 가스 인큐베이터에서 시 소-이동 로커에 낮은 첨부 접시를 놓습니다. 분 당 ~ 20 회전에서 락 속도 설정 합니다.참고: 때문에 소용돌이 운동 적용 되지 않습니다 우물과 퓨즈의 센터에서 EBs 집계. 되도록 EBs 집계 하지 않는 신중 하 게 흔드는 속도 조정 합니다. 너무 격렬 한 락 물리적으로 EBs를 손상 것 이다.참고: 낮은 산소 압력은 좋습니다 EB 문화에 대 한. EBs (주 7-13 일)의 표면에 hPGCLCs의 생성 갓 20 mL hPGCLC 완전 한 매체 매일 준비 합니다. 락, 없이 EBs 건조 EBs (~0.2 mL/잘 오래 된 매체 남아 있을 수 있습니다) 없이 ~ 1 분 제거 오래 된 매체에 우물의 바닥에 싱크대 것입니다 추가 신선한 hPGCLC 완전 한 매체 매일 (3 mL/음). 3. Immunohistochemical EBs (10 일-13 일)의 얼룩 세포 외 기질 단백질 블록 포름알데히드 조정의 파라핀 끼워 넣어진 (FFPE) immunostaining에 대 한 EBs를 포함 HPGCLCs OCT4로 식별 하기 위해+ 세포, 1.5 mL 낮은 바인딩 microcentrifuge 튜브에 EBs를 수확. EBs 바닥에 싱크 또는 간단히 실 온에서 (2 초)을 원심 및 매체를 삭제 하자. 린스 차가운 PBS(-)와 EBs. PBS(-)를 제거 하 고 차가운 1%(w/v) 나트륨 아 지 드 PBS(-)에 얼음에 5 분의 1 mL에 EBs를 품 어. EBs 바닥에 싱크 또는 간단히 실 온에서 (2 초)을 원심을 하자. 상쾌한, 무시 하 고 차가운 PBS(-)와 EBs를 헹 굴.참고: 나트륨 아 지 드의 세포내 단백질 및 RNA 사본을의 저하 속도가 느려집니다. 얼음에 세포 외 기질 단백질의 200 µ L를 녹여 고 EBs를 포함 하는 microcentrifuge 관에 추가 합니다. 젤 경화 될 때까지 ~ 10 분 동안 실내 온도에 튜브를 둡니다. PBS(-)에 4% 포름알데히드의 1 mL을 추가 하 고 부드러운 락과 15 분 동안 실 온에서 품 어.참고: 모두 EBs와 세포 외 기질 단백질이이 단계 동안 고정 됩니다. 고정, 없이 젤 블록 탈수 과정 중 분해 수 있습니다. 미리 고정된 EBs 젤 블록에 포함 된, EBs 젤 블록으로 다시 고정 하 고-고정 될 수 있습니다. 포름알데히드, 삭제 하 고 차가운 PBS(-) 한번 EBs를 헹 굴. 70% 에탄올의 1 mL를 추가 합니다. 젤 포함 EBs 1 주일에 4 ° C에서 70% 에탄올에 저장할 수 있습니다. 프로세스 표준 FFPE 프로토콜 젤 포함 EBs. 5 μ m 두께 FFPE 슬라이드 준비. 슬라이드 하룻밤 건조 및 immunostaining까지 실내 온도에 그들을 저장 하자.참고: 우리의 일상적인 FFPE 프로토콜은 다음과 같습니다: 70% 에탄올, 2 개의 변화, 1 시간 각각; 80% 에탄올, 변경, 1 시간; 95% 에탄올, 변경, 1 시간; 100% 에탄올, 3 변화, 1.5 시간 각; 크 실 렌, 3 변화, 1.5 시간 각; 파라핀 왁 스 (58-60 ° C), 변화 2 2 시간. 탈수 조직은 파라핀 블록에 포함 되며 3-10 μ m (일반적으로 5 μ m)에서 잘라. 얼룩, 완전히 건조 한 Deparaffinize 적어도 30 분 동안 56 ° C 오븐에서 슬라이드 및 슬라이드 xylenes와 등급된 알코올 시리즈 화. 다음 5 분 동안 수돗물에 슬라이드를 씻어. 내 인 성 peroxidases을 비활성화, 10 분 동안 실내 온도에 BLOXALL 차단 솔루션 rehydrated 슬라이드를 품 어. 다음 슬라이드 PBS 가진 5 분 동안 세척. 20 분 동안 실내 온도에 보통 말 혈 청 (또는 다른 종 생성 된 이차 항 체의 정상적인 세라) 블록 슬라이드. 1 차 항 체를 하룻밤 4 ° C에서 PBS(-)에 0.1 %BSA 희석 안티-10 월-3/4 염소와 슬라이드를 품 어 (각 1 차 항 체에 대 한 희석 및 배양 조건 최적화). 다음 슬라이드 PBS(-)와 실내 온도, 5 분에 세 번 씻어. 30 분 동안 실내 온도에 (양 고추냉이 과산화 효소 활용 된 이차 항 체 말에 의해 생성 된; 참조 테이블의 재료) IgG 항 염소와 슬라이드를 품 어. 다음 슬라이드 PBS(-)와 실내 온도, 5 분에 세 번 씻어. 즉시 사용 하기 전에 필요한 금액 기판 ( 재료의 표참조)을 얼룩이 지는 소량을 혼합 하 고 완전 한 덩어리 얼룩이 솔루션 5 분 모니터 DAB는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 얼룩에 대 한 실 온에서 슬라이드를 품 어 반응을 중지합니다 때 OCT4+ 세포는 신속 하 게 슬라이드 흐르는 수도 물에 헹 궈 서 시각화 됩니다. 등급된 알코올 및 xylenes 시리즈와 함께 슬라이드를 탈수. 슬라이드는 레이저 캡처 서에 대 한 준비가 되었습니다. 설치 매체를 사용 하 여 영구 FFPE 슬라이드 준비 ( 재료의 표참조) 고해상도 현미경 관측을 위해. 4. EBs (10 일-13 일)에서 hPGCLCs의 FACS 농축 효소 혼합 Embryoid 몸 분리 키트 준비 준비 효소 혼합 1 50 µ L을 추가 하 여 효소 P 버퍼 X 및 소용돌이의 1900 µ L. 15 분 동안 37 ° C 물 욕조에 prewarm 효소 혼합 1. 10 µ L 효소 A 20 µ L Y 버퍼에 추가 하 여 효소 믹스 2를 준비 합니다. 믹스 효소 믹스 1과 완전 한 EB 분리 효소 혼합 준비 2. 출신과 EBs 낮은 첨부 접시와 2 분 삭제 상쾌한에 대 한 15 mL 원심 분리기 튜브에 실내 온도, 300 x g에서 원심 분리기에서 EBs를 수확 하 고 10 mL PBS(-)와 EBs를 resuspend. 다시 원심 분리기입니다. 상쾌한 무시 하 고 완전 한 EB 분리 효소 믹스 (4.1.3) EBs resuspend. EBs는 해리 될 때까지 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 EB 정지를 품 어. 외피, 부드럽게 피펫으로 EBs 분리를 촉진 하기 위하여 모든 3-5 분 동안 또는, 자동된 dissociator를 사용 하 여 Embryoid 몸 분리 프로그램. 해리 EB 세포 현 탁 액에 얼음 처럼 차가운 8 mL PBS(-)를 추가 합니다. 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포 현 탁 액을 필터링 합니다. 1 mL로 세척 셀 여과기 차가운 PBS(-) 3 시간. Coulter 카운터를 사용 하 여 필터링 된 셀에에서 셀을 계산 합니다. 4 ° c, 8 분에 대 한 300 x g에 세포 현 탁 액을 원심 하 고 상쾌한 삭제. 얼음 처럼 차가운 10 mL PBS(-)와 셀 펠 릿 resuspend 두 개의 튜브, 아니 얼룩 제어 (10 ~5 셀)과 안티 CD38 얼룩 (모든 나머지 셀)에 대 한 다른으로 세포 현 탁 액을 나눕니다. 4 ° c, 300 x g 8 분에 대 한 두 개의 튜브 원심 안티-CD38 얼룩 및 hPGCLCs FACS 농축 PBS(-)에서 200 µ L 얼음 3% (w/v) BSA 아니 얼룩 제어를 위한 펠 릿 셀과 1% (w/v) 나트륨 아 지 드를 resuspend. Cytometry까지 얼음에 놓습니다.참고: 나트륨 아 지 드의 추가 셀 표면에서 CD38의 국제화 속도가 느려집니다. 안티-CD38 얼음 3% (w/v) BSA와 1% (w/v) 나트륨 아 지 드 PBS(-)에 100 µ L 당 1 x 106 세포를 얼룩이 지기 펠 렛 셀 resuspend FACS 학년, 안티-CD38 APC 활용 된 항 체의 1 x 106 셀 당 10 µ L를 추가 합니다. 커버 알루미늄 호 일로 빛에 노출을 피하기 위해 튜브. 부드러운 락과 45 분 4 ° C에서 품 어. 5 mL을 추가 300 g 8 분 삭제 상쾌한 및 resuspend 셀 x 5 mL와 함께 작은 얼음 PBS(-) 및 4 ° C에서 원심 분리기, 얼음 PBS(-). PBS(-) 세척 총에 세 번 반복 합니다. FACS에 대 한 적절 한 셀 밀도 500 μ 얼음 3% (w/v) BSA와 1% (w/v) 나트륨 아 지 드와 펠 릿 셀 PBS(-)에 resuspend. 풍요롭게 CD38로 hPGCLCs+ 세포, 일반적으로 명확 하 게 고유 세포 인구를 형성. CD38의 식별을 보장 하기 위해 노 얼룩 컨트롤을 사용 하 여+ 세포. HPGCLCs의 일반적인 항복 하루 10 EBs에서 모든 FACS 검사 단일 셀의 1-5% 이며 하루 13 EBs에서 20-40%입니다.

Representative Results

여기에 사용 된 microwell 격판덮개 24 잘 형식에 있으며 각각 최대 1, 200의 형성을 지 원하는 microwell 시트를 들고 8 우물 EBs. 4i 순진한 pluripotency 셀의 약 24 백만에서이 microwell 격판덮개는 일반적으로 ~ 8000 생성 EBs EB 당 3000 ~ 셀으로 구성 된. 비 점착의 문화 EBs 정 락, 동안 그대로 EBs의 수는 점차적으로 자발적인 자기 해체와 ~ 3000 감소 EBs 프로토콜의 하루 13까지 살아남을. EBs를 살아남은 이들 중 대부분이 50-200 hPGCLCs 그들의 표면에 (OCT4 + EBs의 직렬 섹션에서 셀의 immunohistochemical 탐지에 의해 추정, 그림 8참조), ~ 100000 OCT4 + hPGCLCs 총에서 떨어졌다. 단일 세포로 EBs의 효소 소화는 9000-47000 셀에 FACS 농축 CD38 + hPGCLCs의 수확량 감소 상대적으로 비효율적인 프로세스입니다. 우리 손에 실험의 6 개의 독립적인 하지만 연속 배치의 평균이 14,038 ± 5,731 (± sem의 의미) 이었다. CD38-음성 EB 셀 셀 OCT4 mRNA (정량) 또는 단백질 (Immunohistochemistry) 매우 약하게만 표현 하지 않을 경우 완전히 결 석, 모든 EB 셀 강하게 때문에 OCT4 단백질 표현는 사실상 CD38 + hPGCLCs의 전체 인구. 이 프로토콜의 중요 한 매개 변수 셀 밀도 포함합니다. 셀에 대 한 20-30%를 도달할 것 이다 105 인간의 Ipsc x 2.0는 세포 외 기질 단백질 코팅 잘 판의 6 잘 셀 문화 (잘 당 9.60 cm2 성장 지역) 2 mL Y27632 보충 매체 (2.2.9)에 주사는 때 24 confluency (그림 1) 접종 후 시간. Y7632, 셀 집계 및 식민지를 형성의 부재에서 mTeSR1 매체에 추가 24 시간 문화, 후 성장 지역 (그림 2)의 ~ 30%를 점유. 셀 다음 4i 재활 매체 (2.3.2)에 교양. 후에 문화 4i 중간, 세포가 합칠 (그림 3)에서 24 시간. 4i 매체에 추가 24 시간 문화 세포를 밀도가 포장 (그림 4)를 만듭니다. 중간 변경 (4 시간 + 매 24 시간) 및 셀 밀도의 정확한 타이밍은 EBs와 hPGCLCs의 성공적인 형성을 위한 중요 합니다. 48 시간 4i 매체에서 문화, 후 셀 해리 하 고 우물 400 µ m 크기 (2.4)에 microwell 접시에 주사. 비록이 상용 microwell 플레이트 코팅에 대 한 낮은 접착 표면 제조 업체, 신선한 다시 세제 (2.4.3)로 코팅 하 여 원치 않는 세포 접착의 위험을 줄일 수 것이 좋습니다. 800 µ m microwells EB 크기 제대로 감독 차별화의 중요성을 제안 하는 hPGCLCs의 감소 된 수확량 귀착되는. 셀 4i 매체에 주사에서 24-30 시간, 표준, 거꾸로 단계 대조 현미경 (그림 5)를 사용 하 여 관찰 될 수 있는 microwells에 EBs를 형성할 것 이다. EBs의 원형 윤곽에서 및 24 시간의 외피 후에 명확 하 게 표시 된다. (예를 들어, 접종 후 16 시간) 이전 시점에 EBs를 수확 그들의 원형 컨투어 명확 하 게 표시 되기 전에 같은 EBs 기계적 손상에 매우 취약 하 고 쉽게 분해 하기 때문에 권장 하지 않습니다. 상당한 양의 순 hiPSCs 되지 않은 참고 통합 EBs, 정상입니다. 이 비법 인된 셀 락 낮은 부착 표면 (2.5.2)에 EBs의 문화의 개시 전에 멀리 세척 될 것 이다. 또한 note, 우리의 프로토콜에서 EBs 4i 순진한 pluripotency 매체-hPGCLC 매체에에 형성 된다. HPGCLC 매체에 노출 하기 전에 4i 매체에 고체 EBs의 전 형성은 EBs의 표면에 hPGCLCs의 배포에 대 한 중요 합니다. EBs 락, 아래 hPGCLC 매체에 유지 비 점착 문화 상태 집계 또는 융합 (그림 6 및 그림 7) 없이 그들의 둥근 모양을 유지할 것 이다. 너무 약한 상태를 락 EB 집계 및 퓨전, 이지만 너무 가혹한 조건이 EBs 해체 됩니다. 인간의 PGCLCs 8 일 문화 (그림 8)까지 이르면 5 일 문화 hPGCLC 매체에 그들의 숫자가 증가 후 EBs의 표면에 세포 OCT4 표현으로 등장. EBs의 더 인큐베이션 EBs 및 hPGCLCs의 손실의 해체 될 수 있습니다. 인간의 PGCLCs 수 농축 효소 천연된 EB 세포에서 hPGCLC 매체에 있는 문화의 5-8 일 후 FACS에 의해 CD38 + 셀 (그림 9). 그림 1: 인간의 iPSC 세포 배양 매체 Y27632 보충 접종 후 24 시간에에서. 셀 밀도 약 20-30 %confluent. 바위 억제제 Y27632, 존재 셀 잘 긴, 스파이크와 같은 신장으로 확산 하는 경향이. 눈금 막대 100 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2: 인간의 iPSC 세포 배양 접종 후 48 시간. 셀 성장 지역의 ~ 30%를 점령, 식민지를 형성 하는 집계입니다. 눈금 막대 100 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3: 인간의 iPSC 세포 배양 4i 재활 매체에 24 시간 동안 incubated. 셀은 confluency에 도달. 눈금 막대 100 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4: 인간의 iPSC 세포 배양 48 시간에 대 한 4i 재활 매체에서 incubated. Confluent 세포 밀도가 포장 된다. 눈금 막대 100 μ m =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5: EBs는 4i 매체 프로그래밍의 24 시간 보육 후 microwells에서 형성 하는 인간의 iPSC. EBs의 원형 컨투어 접종 후 24 ~ 30 시간에 표시 된다. 단계 대조 현미경 윤곽을 확인 하는 때 EBs 락 문화 조건에 대 한 준비가 되었습니다. 눈금 막대 = 500 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 6: EBs hPGCLC 매체에 24 시간 동안 incubated 인간의 iPSC. EBs는 크게 그들의 둥근 모양을 유지 합니다. 눈금 막대 = 500 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 7: EBs hPGCLC 매체에서 192 시간 동안 incubated 인간의 iPSC. EBs가 24 시간 문화에서 그들의 모습에 비해 확대 하지만 그들은 여전히 크게 집계 또는 퓨전 둥근 모양을 유지. 눈금 막대 = 500 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 8: OCT4 표현 하는 인간의 PGCLCs hiPSC hPGCLC 매체에서 192 시간 동안 incubated EBs의 표면에 지역화 됩니다. EBs는 세포 외 기질 단백질에 포함 되었고 FFPE 슬라이드 immunohistochemical OCT4의 얼룩에 대 한 처리 (DAB 기판). 눈금 막대 = 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 9: 인간 PGCLCs는 농축 효소 천연된 EB 셀에서 FACS CD38로+ 셀. 5-8 일에 대 한 hPGCLC 매체에 부 화, 후 EBs 단일 세포 현 탁 액을 준비 하는 효소 소화에 의해 해리 했다 수 있습니다. hPGCLCs CD38 농축 될 수 있다+ FACS (빨간 점)에 의해 세포. EB 셀 CD38 표현 하지 않는 (파란색 점) 또한 부정적인 제어로 수집 한다. FACS 게이츠 CD38-포지티브 / 네거티브 CD38 셀의 셀의 각 종류의 오염을 피하기 위하여 넓은 여백 (녹색 점)으로 분리 되어야 한다. 상위 및 하위 패널 없이 또는 얼룩, 각각 안티 CD38 항 체와 FACS 프로필 표시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

여기 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 hPGCLCs의 강력한 생산 일반 2 중 karyotype¹⁰인간의 Ipsc의 3 개의 독립적인 클론으로 확인 됐다. 이러한 iPSC 클론 같은 인간의 신생아 피부 피부 섬유 아 세포 세포 문화¹⁰에서 파생 되었다. 그들은 조사 요청 시 및 적절 한 자료 전송 계약 및 배송 냉동된 라이브 인간 세포의 배열에서이 문서의 저자에 의해 제공 됩니다. 그것은 현재 정상 karyotype 우리의 프로토콜 또는 그 다른 실험실에 의해 보고를 사용 하 여 강력한 hPGCLC 생산에 필요한 인지로 알려진.

최근 연구에서 hiPSCs¹¹ 또는 ESCs¹⁴ 교토 대학⁸ 의 사이토의 그룹에 의해 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 hPGCLCs의 생산은 EOMESODERMIN의 표현에 따라, T-상자 전사 요소에 필요한 SOX17의 감 응 작용입니다. SOX17 인간 pluripotent 줄기 세포⁶의 생식 차별화에 녹음 방송 요인 결정 하는 마스터 혈통으로 기능 것으로 보인다. EOMESODERMIN, EOMES 유전자에 의해 부호화 및 EOMES 의 CRISPR/Cas9 녹아웃 생산 조건¹¹, hPGCLC에 SOX17 유도의 거의 완전 한 부재를 발생 및 표현의 다른 유전자의 동일한 패턴에 따라 고 SOX17-null 녹아웃 셀입니다. EOMES에서 유도할 수 있는 벡터에서 EOMESODERMIN의 overexpression-hPGCLC 유도 문화 중 null 녹아웃 셀 효율적으로 강력한 hPGCLC 생산 뿐만 아니라 생식 유전자, SOX17 등의 유도 구조. 반면, 유도 overexpression SOX17는 또한 강력한 PGCLC 생산을 구출 하지 않고 EOMES를 유도. 따라서, EOMESODERMIN SOX17의 중요 한 업스트림 유도 이며이 인간 만능 줄기 세포에서 hPGCLC 유도에 EOMESODERMIN의 단 하나 가장 중요 한 역할을 것으로 보인다. 우리의 프로토콜 hiPSCs¹⁰, SOX17 유도 하지만 EOMESODERMINE 유도에 종속성 결정을 기다리고 있다.

이 프로토콜 변환 액 pluripotency 인간의 Ipsc ERK 독립적인 순진한 pluripotency mTeSR1 매체에서는 수정된 순진한 인간 줄기 세포 매체 (NHSM)⁵중간⁶, 프로그래밍에 4i 96 시간에 대 한 유지 합니다. 같은 인간의 iPSC 클론으로 시작 하지만 다른 상용 인간의 iPSC 성장 매체에 유지 하는 정도의 낮은 hPGCLC 수율의 귀착되 었 다 문화는 4i에 매체를 프로그래밍 하기 전에 hPGCLCs를 생성 하는 우리의 시도 합니다. 다른 미디어에서 장기 적응 hPGCLC 생산을 향상 또는 유지 하지 여부는 미래 연구에 결정 될,이 관찰을 제안 크게 프로그래밍는 4i 전에 인간의 Ipsc의 끝났다 pluripotency의 정확한 상태 EB 형성 4i 매체에서와 hPGCLC 매체에 EB 차별화에 미치는 영향.

HiPSCs 우리의 프로토콜을 다음에서 hPGCLCs의 생산은 강력 하 고 EBs의 다 수의 효율적인 생산을 가능 하 게 microwell 플레이트의 사용 때문에 부분적으로 높은 재현성 (~ 8000 일괄 처리당 EBs) 균일 한 크기 (EB 당 3000 hiPSCs). 쉽게 우리의 프로토콜을 사용 하 여 실험의 단일 일괄 처리에서 생산 하는 EBs의 수는 일반 U-하단 셀 문화 우물을 사용 하는 방법 보다 훨씬 더 큰 수 있습니다. 많은 수의 동등 하 게 크기의 EBs hPGCLCs에 균일 하 게 박 혀의 생산 작은 분자 무게 활성 제 또는 PGC 사양에 영향을 미치는 억제제를 식별 하기 위해 높은 처리량 화학 검사의 기회를 제공할 수 있습니다 또는 그들의 epigenetic 프로그래밍 등 생물학적 특성입니다. 이러한 EBs 또한 생식 세포 이용과, 환경 오염 물질 뿐만 아니라 또한 임상 처방된 약물 화학요법 에이전트 등을 포함 하 여 다 수의 독성 평가에 유용할 수 있습니다.

(I) (ii)를 엄격 하 게 지정 된 셀의 정확한 수를 접종 세포 외 기질 단백질에 mTeSR1에서 유지 하는 건강 한 hiPSCs의 사용을 포함 하는 제시 프로토콜을 사용 하 여 hPGCLCs의 강력 하 고 재현할 수 생산의 중요 한 요소 중간 변경 및 subculture, (iii) 좋은 많은 인간 재조합 BMP4, 및 (iv) 락 문화 중 EBs의 실제 손해를 최소화 하기 위해 선택의 타이밍에 따라. 그것은 우리의 경험 BMP4 시 약의 다른 많은 2 X 또는 더 큰 복용량을 요구 하는 반면 BMP4 시 약의 가장 많은 100 ng/mL 농도에서 일했다. 반면에, hPGCLCs 생산을 사용 하 여 가장 많이 BMP4 BMP4의 더 높은 복용량에서 오히려 감소의 수확량 (예를들면, 200 ng/mL). 여러 다른 많은 hPGCLC 세대를 지 원하는 그들의 성능에 대 한 여러 공급 업체에서 얻은 재조합 인간 BMP4 시 약을 테스트 하 고 최고의 많은의 큰 금액을 확보 하는 것이 좋습니다.

우리의 hPGCLC 프로토콜의 독특한 특징은 hPGCLCs EBs¹⁰ (그림 8)의 가장 바깥쪽 표면 층에 지역화 된 반면 다른 프로토콜 셀 집계⁶^,⁸중간 hPGCLCs를 생성할 수 있습니다. Embryoid 몸 표면, 바깥쪽, 안쪽 껍질, 코어, 등 여러 가지 계층을 형성 하는 경향이 있으며 중앙 코어 지역 종종 프로 살아남은 성장 요인 제공 형태는 문화 뿐만 아니라 영양소, 산소의 제한 된 공급으로 인해 괴 사 성 매체 유포²⁰. EBs의 중심으로 제한 된 보급 때문 가능한 제한 없이 EBs의 표면에 hPGCLCs의 지역화, 시간 및 복용량 제어에 직접 노출 hPGCLCs의 약물 이나 독성 물질에 대 한 도움이 될 수 있습니다 약물 또는 독성에 관한 연구입니다.

마우스 PGCLCs 쇼 강력한 게놈 전체 DNA demethylation는 각 인을 포함 적어도 부분적으로 영역을 제어 하는 반면⁷^,^,¹⁹²⁰, hPGCLCs에서 글로벌 gDNA demethylation의 마우스 보다 약한 것 같다 PGCLCS 또는 PGCs⁶^,⁷. Transcriptomal 프로 파일 hPGCLCs 마우스 PGCLCs¹⁰PGCs 배아의 초기 단계를 유사할 수 있습니다는 것이 좋습니다. 그것은 알려졌다 hPGCLC 생산의 조건 하에서 EBs의 장기간된 문화 gDNA demethylation⁷;의 증가 발생 그러나, 미래 연구에 의해 결정 될 필요 hPGCLCs EBs에서 또는 고립 된 세포로 서의 문화의 장기간 생식 차별화의 고급 단계를 달성할 수 있는 여부.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

우리 인정 시오미 야와타 Chie Owa 초기 연구 기간 동안 기술 지원 합니다. 이 연구는 JHH 승무원 의료 연구 연구소 (FAMRI) 부여와 NIEHS/NIH 보조금 R01 ES023316 및 R21ES024861 TS에 의해 지원 되었다.

Materials

Primed pluripotency hiPSC culture
Matrigel	Corning	354277	Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C
DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	21041-025	Store at 4 °C.
mTeSR1	STEMCELL Technologies	85850	Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance.
Y27632	Axon	1683	Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C.
CryoStor CS10	STEMCELL Technologies	07930	Store at 4 °C.
Accutase	Innovative cell technologies	AT104-500	Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
4i hiPSC culture
KnockOut DMEM	Thermo Fisher Scientific	A1286101
KnockOut Serum Replacement	Thermo Fisher Scientific	10828028	Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C.
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x)	Thermo Fisher Scientific	10378016
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Thermo Fisher Scientific	11140050
Insulin from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	I1882-100MG	Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C.
human LIF	PeproTech	300-05	Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C.
human FGF2	R&D Systems	4114-TC	Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
human TGF-β1	PeproTech	100-21	Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C.
4i basal medium			Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C.
CHIR99021	Axon	1386	Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C.
PD0325901	Axon	1408	Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C.
BIRB796	Axon	1358	Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
SP600125	Tocris	1496	Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C.
AggreWell400	STEMCELL Technologies	27845	Microwell plate
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443	Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t.
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
hPGCLC culture
Glasgow’s MEM	Thermo Fisher Scientific	11710035
Sodium pyruvate (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	11360070
Penicillin-Streptomycin (100x)	Corning	30-002-CI
hPGCLC basal medium			Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C.
2-Mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M3148	Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C.
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C.
Recombinant human BMP4	R&D Systems	314-BP	Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C.
Human SCF	PeproTech	300-07	Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C.
Human EGF	PeproTech	AF-100-15	Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C.
Cell strainer	Corning	352340	Pore size = 40 μm.
50 ml polypropylene conical tube	Corning	352070
Low attachment plate	Corning	3471
Vari-Mix Platform Rocker	Thermofisher	M79735Q
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
Immunohistochemical staining
BLOXALL Blocking Solution	VECTOR	SP-6000
Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG	VECTOR	MP-7405
OCT-3/4 Antibody	Santa Cruz	SC-8629
ImmPACT DAB	VECTOR	SK-4105
Permount	Thermofisher	SP15-100	Mounting medium
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
Isolating hPGCLC
Embryoid Body Dissociation Kit	Miltenyi Biotec	130-096-348
Anti-CD38 antibody conjugated to APC	abcam	ab134399

Referanslar

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Etiketler

Human Primordial Germ Cell-like Cells Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells Germline Toxicology Genomic Impairment Extracellular Matrix Single-cell Suspension Naive Pluripotency 4i Medium Reproducibility Cell Density Cell Culture Model

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Mitsunaga, S., Shioda, K., Isselbacher, K. J., Hanna, J. H., Shioda, T. Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (143), e58297, doi:10.3791/58297 (2019).