جيل من البشرية البدائية الخلية الجرثومية مثل الخلايا على سطح الهيئات امبريويد من بلوريبوتينسي جاهزة للانفجار الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent
Özet
الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) هي السلائف الشائعة للحيوانات المنوية والبيض على حد سواء. بجكس الجنينية البشرية المحددة من الخلايا pluripotent epiblast من خلال التفاعلات السيتوكينات. هنا، نحن وصف بروتوكول 13 يوما لحمل ترانسكريبتومالي الخلايا البشرية تشبه بجكس على سطح الهيئات امبريويد من الخلايا الجذعية pluripotent معبي-بلوريبوتينسي التي يسببها.
Abstract
الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) هي السلائف الشائعة لكافة germline الخلايا. في الأجنة الماوس، عدد سكانها المؤسسين بجكس ~ 40 هي الناجمة من الخلايا epiblast pluripotent مدبرة من التعرض إلى السيتوكينات، بما في ذلك البروتين العظام morphogenetic 4 (Bmp4). في الأجنة البشرية، تم تحديد بجكس أقرب على الجدار اندوديرمال من كيس الصفار حوالي نهاية الأسبوع 3rd للحمل، ولكن يعرف الكثير عن عملية مواصفات PGC البشرية وتنميتها في وقت مبكر. للالتفاف حول الحواجز التقنية والأخلاقية لدراسة بجكس الجنينية البشرية، تولدت نماذج ثقافة الخلية مركب مؤخرا من الخلايا الجذعية pluripotent. هنا، يمكننا وصف بروتوكول 13 يوما لقوى الإنتاج من “الخلايا بجكليكي” البشرية (هبجكلكس). الخلايا الجذعية البشرية المستحثة pluripotent (هيبسكس) في الدولة بلوريبوتينسي معبي المحتضنة في السذاجة 4i إعادة برمجة المتوسطة لمدة 48 ساعة، وفصلها إلى الخلايا المفردة، ومعبأة في ميكروويلس. صيانة طويلة من هيبسكس في ولاية بلوريبوتينسي ساذجة الأسباب الكروموزومي كبيرة وينبغي تجنبها. هيبسكس في ميكروويلس يتم الاحتفاظ لمدة 24 ساعة في المتوسط 4i إلى هيئات النموذج امبريويد (EBs)، التي ثم إضافية المستزرعة في بلاستيكواري المنخفضة-التقيد بشرط هزاز في الأجلين المتوسط والاستقراء هبجكلك التي تحتوي على تركيزات عالية من BMP4 البشري المؤتلف. كذلك تستزرع الحديدية لمدة 8 أيام في حالة هزاز، غير المنتسب للحصول على الحد الأقصى من الغلة من هبجكلكس. طريق إيمونوهيستوتشيميستري، سهولة اكتشاف هبجكلكس كخلايا بقوة الإعراب عن OCT4 في تقريبا جميع الحديدية حصرا على سطحها. عند فصل انزيماتيكالي الحديدية وتعرض لإثراء نظام مراقبة الأصول الميدانية، يمكن جمعها هبجكلكس ك CD38 + الخلايا بنسبة تصل إلى 40-45% العائد.
Introduction
الخلايا الجرثومية الأساسية (بجكس) هي السلائف الشائعة لكافة الخلايا germline في كلا الجنسين. قد تم الحصول على معظم معارفنا حول التنمية بجكس في أجنة الثدييات من خلال دراسة المختبر الفئران1،2. في يوم الجنينية 6.0-6.5 أجنة الفأر، تقع إعداد صغيرة 6 أو ما شابه ذلك من السلائف PGC في ابيبلاست، وعدد سكانها المؤسسين ~ 40 هي التي يسببها بجكس منها بطريقة تعتمد على البروتينات مورفوجينيتيك العظام Bmp2 و Bmp4 ويفرز من المتاخمة الخلايا. وكانت بجكس البشرية أقرب المحددة حتى الآن في الأجنة على الجدار اندوديرمال من كيس الصفار في حوالي نهاية الأسبوع الثالث من الحمل3. لأن هذا هو نفس المكان كما لوحظت بجكس المهاجرة في الأجنة الماوس، فمن المحتمل أن بجكس البشرية الملحوظة في طريق الهجرة ولكن لا السكان المؤسسين. غير أن دراسات تتبع المراحل السابقة العودة بجكس أو PGC السلائف في الأجنة البشرية كانوا في عداد المفقودين.
الوصول إلى بجكس الجنينية البشرية يمثل تحديا بسبب العقبات التقنية والأخلاقية على حد سواء. للتغلب على هذه العقبات، تولدت مؤخرا نماذج الثقافة PGC تشبه خلية من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية (PSCs). بلوريبوتينسي هو القدرة على الهاتف الخلوي للتفريق في germline والطبقات الجرثومية الجنينية الثلاث4. في حين يحتفظ PSCs البشرية في المتوسط mTeSR1 (متوسط جاهزة للاستخدام، والمتاحة تجارياً المعدة لصيانة PSCs البشرية في الدولة بلوريبوتينسي معبي) على أطباق مغطاة بطبقة البروتين المصفوفة خارج الخلية لها بلوريبوتينسي الدولة أعدادا 4وفي عام 2013 ومختبر يعقوب حنا أظهرت أن الخلايا معبي بلوريبوتينسي يمكن أن تتحول إلى دولة بلوريبوتينسي ساذجة بتعريض للسذاجة الخلايا الجذعية البشرية المتوسطة (نهسم) التي تحتوي على مثبطات الكيميائي للبروتين مؤنزم ERK1/2، GSK3، جنك، روك، PKC، و p38 MAPK، فضلا عن عوامل النمو ليف، TGF، بفجف5. من PSCs البشرية السذاجة-بلوريبوتينسي، في عام 2015 إنجاز مجموعة بحوث يقودها حنا والصوراني العظيم أول إنتاج قوية من “الخلايا” البشرية بجكليكي (هبجكلكس) من PSCs6. في وقت لاحق، أفادت عدة مختبرات أخرى، بما في ذلك بلدنا، جيل هبجكلكس من شركات الأمن الخاصة التي تستخدم بروتوكولات مختلفة قليلاً7،،من89،10. دراستنا تقدم دليلاً على أن هبجكلكس التي تم إنشاؤها باستخدام بروتوكولات مختلفة (التي يرد موجز لها في الجدول S1 لدينا دراسة منشورة سابقا10) مماثلة لبعضها البعض10ترانسكريبتومالي. وتؤيد الأدلة المتاحة شبه بجكلكس البشرية إلى بجكس الجنينية البشرية في مرحلة مبكرة قبل المحو جينية العالمية7 و/أو الهجرة تشيموتاكتيك10.
دراسات للماوس بجكس الجنينية والماوس بجكلكس بجكلكس البشرية (مع فقط ولكن وصول محدود جداً إلى بجكس البشرية) قد كشفت عن أن الآليات الجزيئية لمواصفات PGC تختلف اختلافاً كبيرا بين الفأر و الإنسان1،6، 7،،من89،10،11،،من1213،14،15،16 ،17. على سبيل المثال، Prdm14 تلعب أدواراً حاسمة في مواصفات PGC في الأجنة الماوس، ولكن دورها في مواصفات PGC البشرية يبدو محدودة1،15. وفي المقابل، تحريض SOX17 من اوميسوديرمين ضروري ل PGC مواصفات6،،من1114، بينما تبدو هذه عوامل النسخ يمكن الاستغناء عنها للماوس PGC مواصفات15. دعم هذه الإنجازات الأولية للدراسات باستخدام هبجكلكس بشدة أهمية هذا النموذج ثقافة الخلية كبديل بجكس الجنينية البشرية.
وأظهرت دراسات نشرت مؤخرا، التي تنطوي على تقييم تسلسل عميق لدينا مختبر لتحليل عدد نسخ الحمض النووي الجينوم، أن صيانة طويلة الأمنية في الدولة بلوريبوتينسي السذاجة يزيد بشكل ملحوظ مخاطر عدم استقرار الكروموسومات و التشوهات الهيكلية. ولوحظ هذه الظاهرة مع الماوس18 و البشرية19 الأمنية الخاصة. بوضع بروتوكول هبجكلك الإنتاج الأصلي عنها حنا/الصوراني PSCs البشرية في متوسطة بلوريبوتينسي 4i ساذجة لمدة أسبوعين على الأقل6. للحفاظ على تناذر ضعفاني الطبيعي للبشرية PSCs وبجكلكس، قمنا بتطوير بروتوكول معدلة التي يتعرض فيها PSCs البشرية إلى متوسطة 4i لمدة 72 ساعة فقط10، التي ترد في هذه المادة. يتم الاحتفاظ إيبسكس البشرية (هيبسكس) في ظل حالة بلوريبوتينسي معبي. مباشرة قبل تشكيل المجلس التنفيذي، هي الخلايا المحتضنة في 4i السذاجة إعادة برمجة المتوسطة (متوسطة نهسم معدلة) لمدة 48 ساعة. ثم فصل الخلايا ومعبأة في ميكروويلس للنموذج الحديدية ل 24 ساعة إضافية في المتوسط 4i. يتم الاحتفاظ الحديدية في هبجكلك التعريفي المتوسطة التي تحتوي على تركيزات عالية من BMP4 البشري الماشوب تحت شرط هزاز للثقافة لا مرفق لمدة 8 أيام للحصول على أقصى عائد هبجكلكس. بعد 8 أيام EB الثقافة، هبجكلكس يمكن أن تكون معزولة عن ينتابها EB الخلايا بنظام مراقبة الأصول الميدانية CD38 + الخلايا مع ~ 40% العائد في نظام مراقبة الأصول الميدانية فرز تعليق خلية مفردة. حين الأخرى نشر أساليب7،،من89، بما في ذلك البروتوكول الأصلي قبل أن التعديلات6، تولد عادة هبجكلكس في الخلية تلقائياً شكلت المجاميع دون محددة التعريب، يلاحظ هبجكلك التي تنتجها لدينا بروتوكول على سطح الهيئات امبريويد (EBs).
Protocol
Representative Results
Discussion
إنتاج قوي من هبجكلكس استخدام بروتوكول الموصوفة هنا تأكدت باستنساخ المستقل ثلاثة من إيبسكس البشرية مع تناذر ضعفاني العادية10. استنساخ هذه اللجنة التوجيهية مستمدة من نفس جلد الإنسان عن طريق الجلد الولدان تنتجها الخلايا الليفية خلية الثقافة10. أنها ستقدم مؤلفين من هذه المادة إلى المحققين بناء على طلبها وفي إطار اتفاق نقل المواد الملائمة والشحن ترتيب الخلايا البشرية الحية المجمدة. من غير المعروف حاليا ما إذا كان تناذر العادية المطلوبة لإنتاج هبجكلك قوية باستخدام بروتوكول لدينا أو تلك التي أبلغ عنها بغيرها من المختبرات.
وقد أظهرت الدراسات الأخيرة أن إنتاج هبجكلكس من هيبسكس11 أو بتوليدا14 استخدام بروتوكول وصف سيتو للفريق التابع لجامعة كيوتو8 مرهون بالتعبير عن اوميسوديرمين، تي-مربع عامل نسخ المطلوبة تحريض SOX17. ويبدو SOX17 تعمل كنسب رئيسية تحديد عامل النسخ في germline تمايز الخلايا الجذعية pluripotent البشرية6. يتم ترميز اوميسوديرمين بالجينات اومس ، وخروج المغلوب كريسبر/Cas9 من اومس تسبب غياب شبه كامل لتحريض SOX17 في هبجكلك المنتجة للشرط11، والتعبير عن جينات أخرى تتبع نفس النمط من خلايا فارغة SOX17 بالضربة القاضية. أوفيريكسبريسيون اوميسوديرمين من متجه إيندوسيبلي في اوميس–إنقاذ خلايا فارغة بالضربة القاضية خلال الثقافة التعريفي هبجكلك كفاءة الإنتاج هبجكلك قوية فضلا عن تحريض الجينات الخط، بما في ذلك SOX17. وفي المقابل، أنقذ المستحث أوفيريكسبريشن SOX17 أيضا إنتاج بجكلك قوية ولكن دون حمل اومس. وهكذا، اوميسوديرمين محفز المراحل الأولى حرجة من SOX17، ويبدو أن هذا أهم دور واحد من اوميسوديرمين في تحريض هبجكلك من الخلايا الجذعية pluripotent البشرية. لدينا بروتوكول يدفع SOX17 في هيبسكس10، ولكن اعتماده على الاستقراء اوميسوديرميني ينتظر أن يتحدد.
يحول هذا البروتوكول بلوريبوتينسي معبي إيبسكس البشرية الحفاظ على المتوسط mTeSR1 بلوريبوتينسي السذاجة إيرك مستقلة لمدة 96 ساعة في 4i إعادة برمجة متوسطة6، الذي هو بالسذاجة تعديل خلايا الجذعية بشرية متوسطة (نهسم)5. محاولاتنا لتوليد هبجكلكس بدءاً من استنساخ البشر اللجنة التوجيهية نفس ولكن الاحتفاظ بها في غيرها من وسائط النمو اللجنة التوجيهية البشرية المتاحة تجارياً قبل الثقافة في 4i إعادة برمجة المتوسطة أدى إلى تدني هبجكلك المحاصيل بدرجات متفاوتة. على الرغم من أن تحدد ما إذا كان يحسن إنتاج هبجكلك التكيف الأطول أجلاً في وسائل الإعلام الأخرى أو لا يبقى في الدراسات المستقبلية، وهذه الملاحظة تشير إلى أن الدولة الدقيق من بلوريبوتينسي معبي من إيبسكس البشرية قبل 4i إلى حد كبير في إعادة برمجة آثار تشكيل المجلس التنفيذي في المتوسط 4i والتمايز EB في المتوسط هبجكلك.
إنتاج هبجكلكس من هيبسكس بعد أن البروتوكول قوية وعالية استنساخه، جزئيا نتيجة لاستخدام لوحات ميكروويل التي تمكن الإنتاج الفعال لعدد كبير من EBs (~ 8,000 الحديدية كل دفعة) مع حجم موحد (هيبسكس 3,000 الواحدة EB). قد يكون عدد الحديدية سهولة إنتاجها في دفعة واحدة من التجربة باستخدام بروتوكول لدينا أكبر بكثير من أساليب استخدام الآبار ثقافة الخلية أسفل يو العادية. إنتاج عدد كبير من نفس القدر من الحجم الحديدية المرصعة موحد مع هبجكلكس قد توفر فرصاً فريدة للفحوص الكيميائية الفائق لتحديد وسائل تفعيل صغيرة الوزن الجزيئي أو الموانع التي تؤثر على مواصفات PGC أو بهم الخصائص البيولوجية مثل إعادة برمجة جينية. هذه الحديدية قد تكون مفيدة لتقييم السمية عدد كبير من germline سميات الخلية، بما في ذلك الملوثات البيئية بل والأدوية الموصوفة طبيا أيضا مثل وكلاء العلاج الكيميائي أيضا.
وتشمل العوامل الحاسمة لإنتاج قوية واستنساخه من هبجكلكس استخدام بروتوكول قدم (ط) استخدام هيبسكس صحية الاحتفاظ بها في mTeSR1 على البروتين المصفوفة خارج الخلية، (الثاني) لتطعيم العدد الدقيق للخلايا كما هو محدد وصارم اتبع أوقات التغير المتوسط وثقافة فرعية، (ثالثا) لتحديد الكثير جيدة BMP4 الماشوب البشري، و (رابعا) لتقليل الأضرار الجسدية للحديدية خلال ثقافة هزاز. فمن خلال تجربتنا التي عملت الكثير أفضل من كاشف BMP4 100 نانوغرام/مليلتر تركيز بينما الأخرى الكثير من الكواشف BMP4 المطلوب 2 X أو جرعات أكبر. العائد من هبجكلكس استخدام الإنتاج الكثير أفضل من BMP4 بدلاً من ذلك انخفضت في جرعات أعلى من BMP4 من ناحية أخرى (مثلاً 200 نانوغرام/ملليلتر). نوصي باختبار عدة الكثير مختلفة من المؤتلف الكواشف BMP4 البشرية التي تم الحصول عليها من بائعين متعددين لأدائها في دعم جيل هبجكلك وتأمين كمية كبيرة من الكثير أفضل.
ميزة فريدة من نوعها لدينا بروتوكول هبجكلك أن يتم ترجمة هبجكلكس على الطبقة السطحية الأبعد الحديدية10 (الشكل 8)، بينما يمكن أن تولد البروتوكولات الأخرى هبجكلكس في منتصف الخلية المجاميع6،8. الهيئات امبريويد تميل إلى تكوين طبقات متميزة متعددة مثل السطح والغلاف الخارجي وشل الداخلية والأساسية، وغالباً ما تكون المناطق الأساسية المركزية نخرية نظراً لمحدودية العرض من المغذيات والأوكسجين، فضلا عن الباقين على قيد الحياة للمحترفين عوامل النمو قدمت نموذج ثقافة المتوسطة بنشر20. قد يكون من المفيد للتعرض المباشر، تسيطر عليها الوقت والجرعة من هبجكلكس للأدوية أو المواد السامة لتعريب هبجكلكس على سطح الحديدية دون قيود ممكنة نظراً لمحدودية نشر نحو مركز الحديدية الدوائية أو الدراسات السمية.
بينما التحكم الماوس بجكلكس إظهار قوية على نطاق الجينوم الحمض النووي ديميثيلاتيون المتعلقة الطباعة المناطق جزئيا على الأقل7،،من1920درجة demethylation جدنا العالمية في هبجكلكس يبدو أضعف من الماوس بجكلكس أو بجكس6،7. ترانسكريبتومال الملامح تشير إلى أن هبجكلكس قد تتشابه في مرحلة مبكرة من بجكس الجنينية من الماوس بجكلكس10. وذكر أن ثقافة الحديدية تحت ظروف الإنتاج هبجكلك طويلة بسبب درجة زيادة من جدنا demethylation7؛ ومع ذلك، ما إذا كانت فترة ممتدة من ثقافة هبجكلكس الحديدية أو كخلايا معزولة يمكن تحقيق المراحل الأكثر تقدما من التمايز germline يحتاج إلى تحددها الدراسات المستقبلية.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونعترف Yawata شيومي واللجنة Owa للمساعدة التقنية من خلال الدراسات الأولية. تم دعم هذه الدراسة نيس/المعاهد الوطنية للصحة منح R01 ES023316 و R21ES024861 للملخص، ومنحة مضيفات معهد البحوث الطبية (فامري) إلى جه.
Materials
| Primed pluripotency hiPSC culture | |||
| Matrigel | Corning | 354277 | Aliquot Matrigel at the volume indicated by the manufacturer (about 200 μL). Use cold tubes. Store at -80 °C |
| DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 21041-025 | Store at 4 °C. |
| mTeSR1 | STEMCELL Technologies | 85850 | Reconstitute by adding 5X Supplement to Basal Medium. The reconstituted medium can be stored at 4 °C for up to 4 weeks without affecting cell culture performance. |
| Y27632 | Axon | 1683 | Dilute 5 mg Y27632 (MW 320.26) with 312.2 μL water to prepare 50 mM Y27632 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 μm). Aliquot 20 μL/tube x 15 tubes and store at -20 °C. |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | 07930 | Store at 4 °C. |
| Accutase | Innovative cell technologies | AT104-500 | Cell dissociation enzyme; aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
| Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
| 4i hiPSC culture | |||
| KnockOut DMEM | Thermo Fisher Scientific | A1286101 | |
| KnockOut Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828028 | Aliquot 40 mL/tube x 12 tubes and store at -20 °C. |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | Thermo Fisher Scientific | 10378016 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| Insulin from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | I1882-100MG | Add 0.1 mL glacial acetic acid to 10 mL water. Sterilize by filtration (0.22 um). Dilute 100 mg insulin lyophilized powder with cold 10 mL the acidified water to make 10 mg/mL stock solution. Aliquot 650 μL/tube x 15 tubes and store at -80 °C. |
| human LIF | PeproTech | 300-05 | Reconstitute 250 μg human LIF with 250 μL water. Add 750 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human LIF stock solution. Specific activity of this product is >10,000 units/μg. Aliquot 40 ul/tube x 25 tubes and store at -80 °C. |
| human FGF2 | R&D Systems | 4114-TC | Reconstitute 1 mg human FGF2 with 5 mL PBS(-) to make 200 μg/mL human FGF2 stock solution. Aliquot 100 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
| human TGF-β1 | PeproTech | 100-21 | Reconstitite 50 μg with 50 μL of 10 mM Citric Acid (pH 3.0). Add 150 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL human TGF-β1 stock solution. Aliquot 4 μL/tube x 50 tubes and store at -80 °C. |
| 4i basal medium | Mix the following reagents to make 4i basal medium. 500 mL of KnockOut DMEM 100 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 650 µL of 10 mg/mL Insulin from bovine pancreas 40 µL of 250 µg/mL human LIF 20 µl of 200 µg/ml human FGF2 4 µl of 250 µg/ml human TGF-β1 Aliquots 40 ml/tube and store at -80 °C. |
||
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Reconstitute 25 mg CHIR99021 (MW 465.34) with 1791 μL DMSO to make 30 mM CHIR99021 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 35 tubes and store at -20 °C. |
| PD0325901 | Axon | 1408 | Reconstitute 5 mg PD0325901 (MW 482.19) with 1037 μL DMSO to make 10 mM PD0325901 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 20 tubes and store at -20 °C. |
| BIRB796 | Axon | 1358 | Reconstitute 10 mg BIRB796 (MW 527.66) with 948 μL DMSO to make 20 mM BIRB796 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
| SP600125 | Tocris | 1496 | Reconstitute 10 mg SP600125 (MW220.23) with 908 μL DMSO to make 50 mM SP600125 stock solution. Aliquot 50 μL/tube x 18 tubes and store at -20 °C. |
| AggreWell400 | STEMCELL Technologies | 27845 | Microwell plate |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Reconstitute 5 g Pluronic F-127 in 100 mL water to make 5%(w/v) Pluronic F127 stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliqout 50 mL/tube x 2 tubes and store at r.t. |
| Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
| hPGCLC culture | |||
| Glasgow’s MEM | Thermo Fisher Scientific | 11710035 | |
| Sodium pyruvate (100 mM) | Thermo Fisher Scientific | 11360070 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| hPGCLC basal medium | Mix the following reagents to make hPGCLC basal medium. 500 mL of Glasgow’s MEM 75 mL of KnockOut Serum Replacement 6 mL of MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) 6 mL of 100 mM Sodium pyruvate 6 mL of Penicillin-Streptomycin (x100) Aliquots 40 mL/tube and store at -20 °C. |
||
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | Dilute 350 μL 2-Mercaptoethanol (14.3 M) in 9.65 mL PBS(-) to make 500 mM 2-Mercaptoethanol stock solution . Store at 4 °C. |
| L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Reconstitute 400 mg L-Ascorbic acid with 20 mL water to make 20 mg/mL L-Ascorbic acid stock solution. Sterilize by filtration (0.22 um). Aliquot 500 μL/tube x 40 tubes and store at -20 °C. |
| Recombinant human BMP4 | R&D Systems | 314-BP | Reconstitute 1 mg recombinant human BMP4 with 10 mL of 4mM HCl aq. to make 100 μg/mL recombinant human BMP4 stock solution. Aliquot 250 μL/tube x 40 tubes and store at -80 °C. |
| Human SCF | PeproTech | 300-07 | Reconstitute 250 μg human SCF with 500 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 500 μg/mL human SCF stock solution. Aliquot 35 μL/tube x 14 tubes and store at -80 °C. |
| Human EGF | PeproTech | AF-100-15 | Reconstitute 1 mg human EGF with 1 mL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 1 mg/mL human EGF stock solution. Aliqot 100 μL/tube x 10 tubes. Dilute 100 μL of 1 mg/ml human EGF stock solution with 300 μL of 0.1% bovine serum albumin in PBS(-) to make 250 μg/mL humanEGF stock solution. Aliquot 20 μL/tube x 20 tubes. Store at -80 °C. |
| Cell strainer | Corning | 352340 | Pore size = 40 μm. |
| 50 ml polypropylene conical tube | Corning | 352070 | |
| Low attachment plate | Corning | 3471 | |
| Vari-Mix Platform Rocker | Thermofisher | M79735Q | |
| Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
| Immunohistochemical staining | |||
| BLOXALL Blocking Solution | VECTOR | SP-6000 | |
| Normal Horse serum ImmPRESS Reagent Anti-Goat IgG |
VECTOR | MP-7405 | |
| OCT-3/4 Antibody | Santa Cruz | SC-8629 | |
| ImmPACT DAB | VECTOR | SK-4105 | |
| Permount | Thermofisher | SP15-100 | Mounting medium |
| Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
| Isolating hPGCLC | |||
| Embryoid Body Dissociation Kit | Miltenyi Biotec | 130-096-348 | |
| Anti-CD38 antibody conjugated to APC | abcam | ab134399 |
Referanslar
- Magnúsdóttir, E., Surani, M. A. How to make a primordial germ cell. Development. 141 (2), 245-252 (2014).
- Saitou, M., Yamaji, M. Primordial germ cells in mice. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 4 (11), a008375 (2012).
- De Felici, M. Origin, Migration, and Proliferation of Human Primordial Germ Cells. Oogenesis. (Chapter 2), 19-37 (2012).
- Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 17, 155-169 (2016).
- Gafni, O., Weinberger, L., et al. Derivation of novel human ground state naive pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
- Irie, N., Weinberger, L., et al. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell. 160 (1-2), 253-268 (2015).
- von Meyenn, F., Berrens, R. V., et al. Comparative Principles of DNA Methylation Reprogramming during Human and Mouse In vitro Primordial Germ Cell Specification. Developmental Cell. 39 (1), 104-115 (2016).
- Sasaki, K., Yokobayashi, S., et al. Robust In vitro Induction of Human Germ Cell Fate from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 17 (2), 178-194 (2015).
- Sugawa, F., Araúzo-Bravo, M. J., et al. Human primordial germ cell commitment in vitro associates with a unique PRDM14 expression profile. The EMBO Journal. 34 (8), 1009-1024 (2015).
- Mitsunaga, S., Odajima, J., et al. Relevance of iPSC-derived human PGC-like cells at the surface of embryoid bodies to prechemotaxis migrating PGCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (46), E9913-E9922 (2017).
- Kojima, Y., Sasaki, K., et al. Evolutionarily Distinctive Transcriptional and Signaling Programs Drive Human Germ Cell Lineage Specification from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (4), 517-532 (2017).
- Irie, N., Surani, M. A. Efficient Induction and Isolation of Human Primordial Germ Cell-Like Cells from Competent Human Pluripotent Stem Cells. Methods in Molecular Biology. 1463 (Chapter 16), 217-226 (2017).
- Magnúsdóttir, E., Dietmann, S., et al. A tripartite transcription factor network regulates primordial germ cell specification in mice. Nature Cell Biology. 15 (8), 905-915 (2013).
- Chen, D., Liu, W., et al. Germline competency of human embryonic stem cells depends on eomesodermin. Biology of Reproduction. 97 (6), 850-861 (2017).
- Saitou, M., Miyauchi, H. Gametogenesis from Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 18 (6), 721-735 (2016).
- Hayashi, K., Ohta, H., Kurimoto, K., Aramaki, S., Saitou, M. Reconstitution of the mouse germ cell specification pathway in culture by pluripotent stem cells. Cell. 146 (4), 519-532 (2011).
- Kobayashi, T., Zhang, H., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature. 546 (7658), 416-420 (2017).
- Choi, J., Huebner, A. J., et al. Prolonged Mek1/2 suppression impairs the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 548 (7666), 219-223 (2017).
- Miyoshi, N., Stel, J. M., et al. Erasure of DNA methylation, genomic imprints, and epimutations in a primordial germ-cell model derived from mouse pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (34), 9545-9550 (2016).
- Shirane, K., Kurimoto, K., et al. Global Landscape and Regulatory Principles of DNA Methylation Reprogramming for Germ Cell Specification by Mouse Pluripotent Stem Cells. Developmental Cell. 39 (1), 87-103 (2016).
