Génération des cellules de knock-out primaire et élargi NK humaine à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines
Özet
Nous présentons ici un protocole visant à modifier génétiquement les cellules primaires ou agrandis humaines tueuses naturelles (NK) à l’aide de Cas9 ribonucléoprotéines (Cas9/RNP). En utilisant ce protocole, nous avons généré des cellules NK humaines déficients pour transformer le récepteur du facteur de croissance – b 2 (TGFBR2) et de l’hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).
Abstract
CRISPR/Cas9 technologie s’accélère génie de génome dans plusieurs types de cellules, mais jusqu’à présent, livraison de gène et gène stable modification ont été difficiles dans les cellules NK primaires. Par exemple, livraison de transgene en utilisant des gènes ou retroviral transduction a entraîné un rendement limité de cellules NK par génie génétique en raison de l’apoptose des cellules NK associée à procédure substantiel. Nous décrivons ici une méthode sans ADN pour l’édition de génome de cellules NK primaires et élargis humaines utilisant des complexes ribonucléoprotéiques Cas9 (Cas9/RNP). Cette méthode a permis knockout efficace des TGFBR2 et HPRT1 de gènes dans les cellules NK. Les données de RT-PCR ont montré une diminution significative du niveau d’expression de gène, et un essai de cytotoxicité d’un produit de cellules représentant a suggéré que les cellules NK RNP modifiés sont devenus moins sensibles aux TGFβ. Des cellules génétiquement modifiées pourraient être élargi post-électroporation de stimulation avec irradiés mbIL21 exprimant des cellules nourricières.
Introduction
Immunothérapie contre le cancer a progressé ces dernières années. Les cellules de T de récepteurs (voiture) antigène chimérique génétiquement modifiés sont un excellent exemple de cellules immunitaires machinés, déployé en immunothérapie contre le cancer. Ces cellules ont été récemment approuvés par la FDA pour le traitement contre CD19 + B des cellules malignes, mais succès a été jusqu’à présent limitée aux maladies portant quelques antigènes targetable et ciblant ces répertoires antigéniques limitées est sujette à l’échec par évasion immunitaire. En outre, les cellules T de voiture ont surtout portés sur l’utilisation de cellules autologues de T en raison du risque de greffe – versus – host disease causée par les cellules T allogéniques. En revanche, les cellules NK sont capables de tuer des cibles tumorales de manière indépendante de l’antigène et n’entraînent pas de greffon contre l’hôte, qui en fait un bon candidat pour le cancer immunotherapy6,7,8,9.
CRISPR/Cas9 technologie a été utilisée récemment en ingénierie des cellules immunitaires, mais génétiquement la reprogrammation des cellules NK avec des plasmides a toujours été difficile. Cela a été en raison de difficultés dans la livraison du transgène dans une manière dépendante de l’ADN telles que des gènes et retroviral transduction provoquant l’apoptose des cellules NK associée à procédure substantiel et la production limitée de génétiquement modifié NK cellules4 , 9.
Nombreuses cellules immunitaires innées expriment des niveaux élevés des récepteurs des profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés tels que gène inductible par l’acide rétinoïque j’ai (RIG-I), qui permettent une reconnaissance accrue de l’ADN étranger. Suppression de ces voies a permis une plus grande efficacité de transduction dans les cellules NK lors de l’utilisation de méthodes basées sur l’ADN pour la modification génétique10.
Nous décrivons ici la méthode d’utilisation d’un montage de génome sans ADN des cellules NK humains utilisant des complexes ribonucléoprotéiques de Cas9 (Cas9/RNP) primaires et élargis. Cas9/RNP est composé de trois éléments, recombinant Cas9 protéine complexé avec ARN simple-guide synthétique comprenant un complexé crRNA et tracerRNA. Ces Cas9/RNP sont capables de clivage des cibles génomiques à rendement élevé par rapport aux approches d’ADN-dépendante étrangers en raison de leur livraison sous forme de complexes fonctionnels. En outre, une clairance rapide de Cas9/RNP des cellules peut réduire les effets hors cible, tels que l’induction de l’apoptose. Ainsi, ils peuvent servir à générer des débouchures ou knock-ins lorsqu’il est combiné avec l’ADN de recombinaison homologue6,7. Nous avons montré qu’électroporation de Cas9/RNP est une méthode simple et relativement efficace qui permet de surmonter les contraintes précédentes de modification génétique dans les cellules NK.
TGFβ est une cytokine immunosuppressive importante, qui inhibe l’activation et les fonctions des cellules NK. Il a été suggéré que ciblant la voie de TGFβ peut augmenter les fonctions des cellules immunitaires. Nous avons ciblé la région codant ectodomaine TGBR2 qui lie le TGFβ11. Les résultats représentatifs montrent une diminution significative du niveau d’expression de l’ARNm du gène et ailleurs démontrent que les cellules NK modifiés deviennent résistantes aux TGFβ. En outre, les cellules modifiées maintenir la viabilité et le potentiel prolifératif, qu’ils sont capables d’être élargi post-électroporation utilisant des cellules irradiées chargeur. Par conséquent, la méthode suivante est une approche prometteuse pour manipuler génétiquement des cellules NK pour tout autres cliniques ou des fins de recherche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modification de l’ADN-dépendante des cellules NK a été difficile de4,9. Nous, donc, introduit directement un complexe synthétique préformé ribonucléoprotéines (RNP) et Cas9 protéine comme la protéine purifiée dans primaire et élargi de cellules NK8. Cette méthode nous a permis d’éliminer le plafonnement, équeutage, et autres processus de transcriptionnelles et translationnelles a commencé par l’ARN polymérase II, ce …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous reconnaissons Brian Tullius pour son aide dans l’édition du manuscrit.
Materials
| RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail | STEMCELL Technologies | 15065 | The RosetteSep™ Human NK Cell Enrichment Cocktail is designed to isolate NK cells from whole blood by negative selection. |
| Ficoll-Paque® PLUS | GE Healthcare – Life Sciences | 17-1440-02 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 tracrRNA | Integrated DNA Technologies | 1072532 | TracrRNA that contains proprietary chemical modifications conferring increased nuclease resistance. Hybridizes to crRNA to activate the Cas9 enzyme |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA | Integrated DNA Technologies | Synthetically produced as Alt-R® CRISPR-Cas9 crRNA, based on the sequence of designed gRNA targeting the gene of intrest | |
| Alt-R® Genome Editing Detection Kit | Integrated DNA Technologies | 1075931 | Each kit contains T7EI endonuclease, T7EI reaction buffer, and T7EI assay controls. |
| Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304-011 | |
| 4D-Nucleofector™ System | Lonza | AAF-1002B | |
| Human recombinant IL-2 Protein | Novartis | 65483-0116-07 | |
| P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit | Lonza | V4XP-3032 | Contains pmaxGFP™ Vector, Nucleofector™ Solution, Supplement, 16-well Nucleocuvette™ Strips |
| Non-targeting: Custom siRNA, Standard 0.05 2mol ON-TARGETplus | Dharmacon | CTM-360019 | |
| Alt-R® S.p. Cas9 Nuclease 3NLS | Integrated DNA Technologies | 1074181 | Cas9 Nuclease |
| DNeasy® Blood & Tissue Handbook | Qiagen | 69504 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Calcein AM | ThermoFisher | C3099 | |
| TGFβ | Biolegend | 580706 | |
| Alt-R® CRISPR-Cas9 Control Kit, Human | Integrated DNA Technologies | 1072554 | Includes tracrRNA, HPRT positive control crRNA, negative control crRNA#1, HPRT Primer Mix, and Nuclease-Free Duplex Buffer. |
| IDTE pH 7.5 (1X TE Solution) | Integrated DNA Technologies | 11-01-02-02 | |
| Alt-R® Cas9 Electroporation Enhancer | Integrated DNA Technologies | 1075915 | Cas9 Electroporation Enhancer |
Referanslar
- Guven, H., et al. Efficient gene transfer into primary human natural killer cells by retroviral transduction. Experimental Hematology. 33 (11), 1320-1328 (2005).
- Alici, E., Sutlu, T., Sirac Dilber, M. Retroviral gene transfer into primary human natural killer cells. Methods in Molecular Biology. 508, 127-137 (2009).
- Carlsten, M., Childs, R. W. Genetic Manipulation of NK Cells for Cancer Immunotherapy: Techniques and Clinical Implications. Frontiers in Immunology. 6, 266 (2015).
- Mehta, R. S., Rezvani, K. Chimeric Antigen Receptor Expressing Natural Killer Cells for the Immunotherapy of Cancer. Frontiers in Immunology. 283, 9 (2018).
- Zuris, J. A., et al. Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo. Nature Biotechnology. 33 (1), 73-80 (2015).
- Wang, M., et al. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles. PNAS. 113 (11), 2868-2873 (2016).
- Liang, Z., et al. Efficient DNA-free genome editing of bread wheat using CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Nature Communications. 8, 14261 (2017).
- DeWitt, M. A., Corn, J. E., Carroll, D. Genome editing via delivery of Cas9 ribonucleoprotein. Methods. , 9-15 (2017).
- Rezvani, K., Rouce, R., Liu, E., Shpall, E. Engineering Natural Killer Cells for Cancer Immunotherapy. Molecular Therapy. 25 (8), 1769-1781 (2017).
- Sutlu, T., et al. Inhibition of intracellular antiviral defense mechanisms augments lentiviral transduction of human natural killer cells: implications for gene therapy. Human Gene Therapy. 23 (10), 1090-1100 (2012).
- Viel, S., et al. TGF-beta inhibits the activation and functions of NK cells by repressing the mTOR pathway. Science Signaling. 9 (415), (2016).
- Somanchi, S. S., Senyukov, V. V., Denman, C. J., Lee, D. A. Expansion, purification, and functional assessment of human peripheral blood NK cells. JoVE. (48), (2011).
- Lee, D. A., Verneris, M. R., Campana, D. Acquisition, preparation, and functional assessment of human NK cells for adoptive immunotherapy. Methods in Molecular Biology. , 61-77 (2010).
- Vouillot, L., Thelie, A., Pollet, N. Comparison of T7E1 and surveyor mismatch cleavage assays to detect mutations triggered by engineered nucleases. G3. 5 (3), 407-415 (2015).
- Eyquem, J., et al. Targeting a CAR to the TRAC locus with CRISPR/Cas9 enhances tumour rejection. Nature. 543 (7643), 113-117 (2017).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Research. 24 (6), 1012-1019 (2014).
- Chmielecki, J., et al. Genomic Profiling of a Large Set of Diverse Pediatric Cancers Identifies Known and Novel Mutations across Tumor Spectra. Kanser Araştırmaları. 77 (2), 509-519 (2017).
- Schultz, L. M., Majzner, R., Davis, K. L., Mackall, C. New developments in immunotherapy for pediatric solid tumors. Current Opinion in Pediatrics. 30 (1), 30-39 (2018).
