Oclusão de filamento intraluminal da artéria cerebral média é o modelo mais frequentemente utilizadas na vivo do acidente vascular cerebral experimental em roedores. Uma abordagem alternativa cirúrgica para permitir a reparação de artéria carótida comum é realizada aqui, que permite a reperfusão da artéria carótida comum e uma reperfusão completa no território da artéria cerebral média.
O acidente vascular cerebral isquêmico é das principais causas de incapacidade a longo prazo adulta e morte em todo o mundo. Os tratamentos atuais disponíveis são limitados, com apenas ativador do plasminogênio tecidual (tPA) como um tratamento de droga aprovada para o alvo Derrames isquêmicos. A pesquisa atual em matéria de acidente vascular cerebral isquêmico centra-se na melhor compreensão da fisiopatologia do curso, para desenvolver e investigar novos alvos farmacêuticos. Modelos de curso experimental confiança são cruciais para a progressão de potenciais tratamentos. O modelo de oclusão (MCAO) da artéria cerebral média é clinicamente relevante e o mais frequentemente usado modelo cirúrgico de acidente vascular cerebral isquêmico em roedores. No entanto, os resultados deste modelo, tais como o volume da lesão, estão associados com altos níveis de variabilidade, particularmente em camundongos. O modelo alternativo de MCAO descrito aqui permite a reperfusão da artéria carótida comum (CCA) e a perfusão aumentada do território da artéria cerebral média (MCA), usando uma almofada de tecido com selante baseado em fibrinogênio para reparar o navio e o melhor bem-estar dos ratos, evitando a ligadura da artéria carótida externa (ECA). Isto reduz a dependência sobre o círculo de Willis, que é conhecido por ser anatomicamente altamente variável em camundongos. Dados representativos mostram que usar esta abordagem alternativa cirúrgica diminui a variabilidade em volumes de lesão entre a abordagem tradicional de MCAO e a abordagem alternativa descrita aqui.
Das principais causas de derrame cerebral é isquemia focal no território da artéria cerebral média. Ativador de plasminogênio tecidual (tPA) é o tratamento farmacológico somente disponível com eficácia comprovada, apesar de numerosos testes clínicos direcionados para acidente vascular cerebral isquêmico1,2. No entanto, devido a preocupações de segurança e uma janela terapêutica estreita (< 4,5 h), apenas ~ 15% de todos os pacientes com AVC são elegíveis para receber o tPA, e as taxas de recanalização podem ser < 50%3,4.
Reprodutíveis e clinicamente relevantes de modelos animais de AVC são considerados essenciais para informar o desenvolvimento de tratamentos terapêuticos de tempos novos e potenciais. No entanto, devido a preocupações sobre a consistência e a variabilidade nos resultados com modelos animais, continua a ser importante refinar os modelos na vivo existente para melhorar a tradução de estudos pré-clínicos para a clínica. A falta de tradução da eficácia pré-clínica experimental de tratamentos potenciais para uso clínico é uma preocupação constante para o curso de pesquisa5. Razões do fracasso da tradução são susceptíveis de ser múltiplo e podem estar relacionadas com, por exemplo, o delineamento experimental, atrasos de tratamento, heterogeneidade clínica de acidente vascular cerebral, e as limitações dos modelos animais utilizados6. Um desafio fundamental para a investigação de acidente vascular cerebral continua a ser o desenvolvimento de tratamentos seguros e eficazes.
Oclusão da artéria cerebral média (MCAO) pela inserção de filamento intraluminal é o mais frequentemente usadas em vivo modelo roedor do curso experimental. Esse modelo permite que a restauração do fluxo sanguíneo após uma indução de isquemia, imitando os eventos que ocorrem no curso humano7. No entanto, em particular nos ratos, volumes de lesão heterogênea com variados desvios-padrão ocorrerem apesar de definidos protocolos cirúrgicos são aplicadas8,9,10. É comum ver uma distribuição bimodal de pequeno striatal e lesão striato-cortical grandes volumes11. Para induzir isquemia, o filamento é normalmente inserido através de uma incisão do CCA ou ECA que então permanecem permanentemente ligados12. A ligadura permanente do CCA impede o restabelecimento do fluxo sanguíneo na artéria carótida interna (ACI) e, posteriormente, o território MCA. Isso faz com que a reperfusão ser dependente do suprimento colateral dentro do círculo de Willis (vaca). A estrutura de vaca tem variabilidade anatômica entre animais individuais, particularmente em C57BL/6 ratos-a cepa normalmente usada na vivo derrame pesquisa13. Um método alternativo, da inserção de filamento através do ECA, que permite a perfusão contínua através do CCA, mas compromissos deste método o suprimento arterial para o território do TCE, que mostrou, em ratos, para ter um efeito prejudicial sobre do animal bem-estar14.
A dependência da vaca para suprimento colateral e reperfusão no modelo MCAO estabelecido, em parte, explica a variabilidade de volume de lesão após a oclusão. Descrevemos um procedimento cirúrgico murino alternativo onde ligadura ECA é evitada e a incisão de CCA é reparada, permitindo assim a reperfusão através do CCA, independente da vaca. O reparo da incisão CCA tem demonstrado anteriormente em ratos para resultar em uma bem sucedida reperfusão através do CCA15. Podemos ter aplicado essa abordagem com êxito em ratos11 e apresente-se aqui o protocolo que resulta em uma variabilidade reduzida no volume da lesão, as principais medidas utilizadas em estudos experimentais de AVC.
Neste protocolo, demonstramos como empreender MCAO através da inserção de filamentos de navio CCA seguida de reparação de embarcação CCA, que envolve uma aplicação de selante e almofada de tecido para permitir a reperfusão.
Indução de filamento de transiente MCAO em roedores é o mais utilizado modelo de curso experimental, pois permite reperfusão na área afetada, imitando a ocorrência de eventos após acidente vascular cerebral isquêmico clínica7. Relatado aqui é uma abordagem cirúrgica alternativa ao método tradicional de induzida por filamento MCAO transitória em ratos. A abordagem alternativa, envolvendo tratamento de analgesia, evasão de ligadura do TCE e reparação de incisão de CCA, resulta em uma reduzida variabilidade de LV quando avaliados usando MRI e métodos de coloração histológica11.
Abordagens tradicionais para induzir MCAO largamente contam sobre a transecção, ou pelo menos a ligadura, do TCE, que mostrou, em ratos, afetam o comportamento de beber e um aumento na perda de peso de corpo seguindo o MCAO14. O protocolo definido aqui, em ratos, com a vacância de ligadura da ECA e adição de analgesia, sugeriu uma redução na perda de peso de corpo seguindo a MCAO com nenhum efeito sobre o volume da lesão. O uso de analgesia é evitado, ou pelo menos não relatado, na maioria dos estudos experimentais de AVC, devido a possíveis efeitos de confusão sobre os resultados experimentais. No entanto, evitar completamente a analgesia não é sempre justificada e há uma necessidade de equilíbrio entre as necessidades de bem-estar dos animais, com a realização dos objectivos científicos.
Diferenças no tamanho do animal, estirpe e anatomia cerebrovascular, além das variações de tamanho e tipo de filamento, todos são sugeridas para influenciar o curso resultados23,24. A abordagem alternativa descrita aqui evita a dependência da vaca durante a reperfusão, reduzindo assim, pelo menos em parte, a variabilidade entre animais no volume da lesão. Anatomia de vaca é altamente variável em camundongos, em particular no C57BL /6 tensão, que é frequentemente utilizada em estudos experimentais de AVC. 90% dos camundongos C57BL/6 têm uma vaca incompleta devido a uma variado posterior comunicação artéria (PcomA) permeabilidade, que pode ter um efeito sobre o volume de danos isquêmicos devido a perfusão insuficiente de estruturas fora do território da MCA,13, 25. reparar o CCA em camundongos, como mostrado aqui, resultados no restabelecimento do sangue fluem através do CCA para a área isquêmica, conforme descrita em ratos15. Os dados representativos aqui mostram que a reparação do CCA aumenta reperfusão, embora o fluxo de sangue no CCA não foi medido diretamente. No entanto, é possível que o cirurgião Visualizar o CCA reperfusão com sangue após a reparação do navio, como ele retorna para um estado de completo e pulsante ao longo do tronco, proximal e distal para o local de reparação. Esta confirmação visual, juntamente com as leituras de flowmetry Doppler laser da área isquêmica, pode ser usada para confirmar o reparo bem sucedido do navio. O tempo entre a aplicação de almofada de tecido e a remoção do clipe de navio desde o CCA pode ter um impacto sobre a patência resultante do CCA, como reduzir o tempo entre a aplicação de almofada de tecido e a remoção do grampo impedirá a almofada de tecido de aderir ao o lado oposto do CCA. Embora tecnicamente desafiador, o procedimento MCAO alternativo explicado aqui não requer nenhumas habilidades adicionais do que aqueles necessários para realizar a indução cirúrgica de MCAO em camundongos.
Tradicionalmente associado com uma alta variabilidade em medidas de resultados, estudos experimentais de AVC podem ter uma tendência a ser de fraca potência. Requisitos éticos e de bem-estar em combinação com preocupações económicas e práticas podem contribuir para estudos, sendo de fraca potência. Reduzindo a variabilidade no resultado e, portanto, produzindo resultados mais consistentes de lesão do outro lado um grupo experimental, cálculos de energia mais eficazes podem ser executados com o objectivo último de estudos devidamente alimentada.
Em conclusão, este procedimento alternativo de reparação do CCA, em ratos, resulta em menor variabilidade de volume de lesão após acidente vascular cerebral experimental e cálculos de energia permite que pequenos grupos experimentais devem ser exigidas para um efeito de tratamento, quando for o caso de teste são usados.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo centro nacional para a substituição, refinamento e redução de animais na pesquisa (NC3Rs; NC/M000117/1 de CG). Os autores agradecer o pessoal da divisão de serviços biomédicos, Universidade de Leicester, para seus cuidados dos animais experimentais e Maria Viskaduraki para seu Conselho de estatístico. Os resultados representativos são adaptados com a permissão de doença modelos & mecanismos11.
0.7mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight – use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2ml |
Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel – manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx – rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
sterile petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50mm sterile petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50mm diameter is required. |
Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |