Intraluminal Filament Okklusion der mittleren zerebralen Arterie ist das am häufigsten verwendete in Vivo Modell der experimentellen Schlaganfall bei Nagetieren. Ein alternativer chirurgischer Ansatz ermöglichen gemeinsame Halsschlagader Reparatur erfolgt hier, wodurch der Reperfusion der gemeinsame Halsschlagader und eine vollständige Reperfusion auf das mittlere zerebrale Arterie-Gebiet.
Der ischämische Schlaganfall ist eine der Hauptursachen von Erwachsenen Erwerbsunfähigkeit und Tod weltweit. Die aktuellen Behandlungsmöglichkeiten sind begrenzt, mit nur Tissue Plasminogen Activator (tPA) als zugelassenes Medikament Behandlung ischämischer Schlaganfälle ausrichten. Aktuelle Forschung auf dem Gebiet des ischämischen Schlaganfalls konzentriert sich auf das bessere Verständnis der Pathophysiologie des Schlaganfalls zu entwickeln und neuartige pharmazeutische Ziele zu untersuchen. Zuverlässige experimentelle Schlaganfall Modelle sind entscheidend für das Fortschreiten der möglichen Behandlungen. Das mittlere zerebrale Arterie Okklusion (MCAO) Modell ist klinisch relevant und die am häufigsten verwendeten chirurgischen Modell des ischämischen Schlaganfalls bei Nagetieren. Jedoch sind die Ergebnisse dieses Modells, wie Läsion Lautstärke, verbunden mit hoher Variabilität, besonders bei Mäusen. Hier beschriebenen alternative MCAO Modell ermöglicht die Reperfusion der gemeinsame Halsschlagader (CCA) und die erhöhte Durchblutung des Gebiets mittlere zerebrale Arterie (MCA), mit einem Gewebe-Pad mit Fibrinogen-basiertes Dichtungsmittel, das Schiff und der verbesserte reparieren Wohlergehen der Mäuse durch äußere Halsschlagader (ECA) Ligatur zu vermeiden. Dies reduziert die Abhängigkeit von Kreis von Willis, die als bekannt ist sehr anatomisch Variable bei Mäusen. Repräsentative Daten zeigen, dass bei dieser alternative chirurgische Vorgehensweise die Variabilität der Läsion Bände zwischen dem traditionellen MCAO-Ansatz und die alternative der hier beschriebene Ansatz verringert.
Eine der Hauptursachen für zerebrale Schlaganfall ist fokale Ischämie im Gebiet der mittleren zerebralen Arterie. Tissue Plasminogen Activator (tPA) ist die nur pharmakologische Behandlung mit nachgewiesener Wirksamkeit, obwohl zahlreiche klinische Medikamentenstudien gezielt zu ischämischen Schlaganfall1,2. Jedoch können aufgrund von Sicherheitsbedenken und ein schmales therapeutisches Fenster (< 4,5 h), nur ca. 15 % aller Schlaganfall-Patienten sind berechtigt tPA zu erhalten, und die Rekanalisation Raten < 50 %3,4.
Reproduzierbar und klinisch relevante Tiermodellen der Schlaganfall gelten als wesentlich für die Entwicklung von neuen und potenziellen Schlaganfall therapeutische Behandlungen zu informieren. Jedoch aufgrund von Bedenken hinsichtlich Konsistenz und Variabilität in den Ergebnissen mit Tiermodellen bleibt es wichtig, bestehende in Vivo Modelle zur Verbesserung der Übersetzung aus präklinischen Studien in die Klinik zu verfeinern. Das Fehlen einer Übersetzung von der präklinischen experimentelle Wirksamkeit der möglichen Behandlungen, klinische Anwendung ist ein ständiges Anliegen für Schlaganfall-Forschung-5. Gründe für das Scheitern der Übersetzung dürften mehrere sein und können mit zusammenhängen, z. B. das Studiendesign, Behandlung Verspätungen, klinischen Schlaganfall Heterogenität und die Grenzen der Tiermodelle verwendet6. Eine zentrale Herausforderung für Schlaganfall-Forschung bleibt die Entwicklung von sicheren und wirksamen Behandlungen.
Mittlere zerebrale Arterie Okklusion (MCAO) durch Intraluminal Filament Einfügung ist das am häufigsten verwendete in Vivo Nagetier Modell der experimentellen Schlaganfall. Dieses Modell ermöglicht die Wiederherstellung der Durchblutung nach einer Ischämie-Induktion, imitiert die Ereignisse, die in menschlichen Takt7auftreten. Jedoch auftreten, insbesondere bei Mäusen, heterogene Läsion Bände mit abwechslungsreichen Standardabweichungen obwohl definiert chirurgischen Protokolle angewandte8,9,10sind. Es ist typisch für eine bimodale Verteilung von kleinen striatalen und große Striato-kortikale Läsion Bände11zu sehen. Ischämie zu induzieren, wird der Faden in der Regel durch einen Schnitt der CCA oder ECA, die dann dauerhaft aufgespaltenen12bleiben eingefügt. Die dauerhafte Unterbindung des CCA verhindert die Wiederherstellung des Blutflusses in der inneren Halsschlagader (ICA) und anschließend die MCA-Gebiet. Dies bewirkt, dass Reperfusion der Sicherheiten Versorgung innerhalb der Kreis von Willis (Kuh) abhängig sein. Die Kuh-Struktur hat anatomische Variabilität zwischen einzelnen Tieren, vor allem in C57BL/6 Mäusen-a Belastung in der Regel in in Vivo Schlaganfall Forschung13verwendet. Eine alternative Methode der Glühfaden Einfügung durch die ECA, lässt der kontinuierliche Perfusion durch die zuständige Behörde, aber diese Methode Kompromisse die arterielle Versorgung der ECA-Gebiet die bei Ratten gezeigt wurde, hat eine nachteilige Wirkung auf des Tieres zu haben Wohlbefinden,14.
Das Vertrauen auf die Kuh für Sicherheiten und Reperfusion in der etablierten MCAO-Modell kann die Läsion Volumen Variabilität nach Okklusion teilweise entfallen. Wir beschreiben eine alternative murine chirurgische Verfahren wo ECA Ligatur wird vermieden und die CCA-Inzision wird repariert, so dass Reperfusion durch CCA, unabhängig von der Kuh. Die Reparatur von der CCA-Schnitt hat zuvor bei Ratten gezeigt, zu einer erfolgreichen Reperfusion durch die CCA15führen. Wir haben diesen Ansatz erfolgreich in Mäusen11 angewendet und berichten hier das Protokoll führt zu einer reduzierten Variabilität in der Läsion Volumen, das Hauptergebnis Maß in experimentellen Schlaganfall Studien verwendet.
In diesem Protokoll führen wir MCAO durch CCA Schiff Filament einsetzen, gefolgt von CCA Schiff Reparatur, beinhaltet eine Gewebe-Pad und Dichtstoff Anwendung erlauben Reperfusion verpflichten.
Filament Induktion von transienten MCAO bei Nagern ist die am häufigsten verwendeten experimentellen Schlaganfall-Modell, wie es Reperfusion auf die betroffene Stelle, imitiert das Auftreten von Ereignissen, die nach klinischen ischämischen Schlaganfall7ermöglicht. Hier berichtet, ist eine chirurgische Alternative zur traditionellen Methode der Filament-induzierte vorübergehende MCAO bei Mäusen. Der alternative Ansatz, eine reduzierte LV-Variabilität beim mittels MRI und histologische Färbung Methoden11Analgesie Behandlung, ECA Ligatur Vermeidung und CCA Einschnitt Reparatur, Ergebnisse beteiligt.
Traditionelle Ansätze induzieren MCAO weitgehend verlassen auf die Durchtrennung oder am wenigsten Ligatur der ECA, die, bei Ratten gezeigt hat, Trinkverhalten und eine Erhöhung der Körper Gewichtsverlust nach der MCAO14beeinflussen. Das Protokoll definiert hier bei Mäusen, bei der Vermeidung von ECA Ligatur und Analgesie hinaus schlug einen Rückgang der Körper Gewichtsverlust nach der MCAO ohne Auswirkung auf die Lautstärke der Läsion. Die Verwendung der Analgesie ist vermieden oder zumindest nicht gemeldet, in der Mehrzahl der Studien experimentelle Schlaganfall, durch mögliche verwirrende Auswirkungen auf den experimentellen Ergebnissen. Allerdings Analgesie vollständig zu vermeiden ist nicht immer gerechtfertigt und es gilt, die Bedürfnisse der Wohlfahrt der Tiere mit der wissenschaftlichen Ziele auszugleichen.
Unterschiede in der Tiergröße, Dehnung und zerebrovaskuläre Anatomie, neben Filament Art und Größe werden alle vorgeschlagen, um Einfluss auf Schlaganfall Ergebnisse23,24. Der hier beschriebene alternative Ansatz vermeidet die Abhängigkeit von der Kuh während Reperfusion, wodurch, mindestens im Teil, die Variabilität zwischen den Tieren in Läsion Band gesehen. Kuh-Anatomie ist sehr variabel in Mäusen, vor allem in der C57BL /6 -Stamm, der häufig in experimentellen Schlaganfall Studien verwendet wird. 90 % der C57BL/6 Mäusen haben eine unvollständige Kuh durch eine abwechslungsreiche posterior kommunizierende Arterie (PcomA) Durchgängigkeit, die sich auf das Volumen der ischämischen Schäden, die durch die unzureichende Perfusion der Strukturen außerhalb der MCA Gebiet13, auswirken 25. Reparatur der CCA bei Mäusen, wie hier gezeigt, führt die Wiederherstellung des Blutes fließen über die CCA zum ischämischen Bereich, wie zuvor beschrieben in Ratten15. Die repräsentativen Daten hier zeigen, dass die Reparatur des CCA Reperfusion, erhöht zwar die Durchblutung in den CCA nicht direkt gemessen wurde. Es ist jedoch möglich, dass der Chirurg, der CCA-Reperfuse mit Blut nach der Schiff-Reparatur, zu visualisieren, wie es zu einem pulsierenden und vollständigen Zustand entlang dem Stamm proximalen und distalen an die Reparatur-Stelle zurück. Diese visuelle Bestätigung, zusammen mit Laser Doppler Flowmetry Lesungen von ischämischen Bereich kann verwendet werden, um die erfolgreiche Reparatur des Schiffes zu bestätigen. Die Zeit zwischen der Gewebe-Pad-Anwendung und die Entfernung von der Gefäß-Clip von der CCA können wirken sich auf die daraus resultierenden Durchgängigkeit des CCA, als Verkürzung der Zeit zwischen der Gewebe-Pad-Anwendung und die Clip-Entfernung wird verhindert, dass das Gewebe-Pad an der o Pposite Seite des CCA. Obwohl technisch anspruchsvoll, erfordert das alternative MCAO-Verfahren wird hier erklärt keine keine zusätzliche Fähigkeiten als erforderlich, um die chirurgische Induktion von MCAO bei Mäusen auszuführen.
Traditionell verbunden mit einer hohen Variabilität der Zielparameter, möglicherweise experimentelle Schlaganfall-Studien eine Tendenz zu schwach sein. Ethik und Tierschutz Anforderungen in Kombination mit wirtschaftlichen und praktischen Bedenken können zu Studien als untermotorisiert beitragen. Durch die Verringerung der Variabilität im Ergebnis und produzieren daher konsequenter Läsion Ergebnisse in einer experimentellen Gruppe, können effektivere macht Berechnungen mit dem letztendlichen Ziel der Studien entsprechend Betrieben durchgeführt werden.
Abschließend diese alternative CCA Reparaturablauf bei Mäusen, führt zu weniger Variabilität in der Läsion Volumen, nach experimentellen Schlaganfall und ermöglicht kleinere Versuchsgruppen zu Testzwecken eine Wirkung der Behandlung gegebenenfalls erforderlich macht Berechnungen dienen.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch das nationale Zentrum für Ersatz, Verfeinerung und Reduzierung von Tieren in der Forschung (NC3Rs; finanziert. NC/M000117/1, CG). Die Autoren danken das Personal der Abteilung der biomedizinischen Services, University of Leicester, für die Betreuung der Versuchstiere und Maria Viskaduraki für ihre statistische Beratung. Die repräsentativen Ergebnisse werden mit freundlicher Genehmigung von Krankheitsmodellen & Mechanismen11angepasst.
0.7mm flexible single fibre optic probe | Moor Instruments, UK | P10d | Use with master probe code: VP10M200ST |
7-0 silicone coated monofilament | Doccol, USA | 701956PKRe | Item dependent on animal size and weight – use manufacteurer guidelines. Product code here was used for representative results shown in article. |
9.4T Preclinical MRI system | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | MY11520101 | Equipped with gradient and RF coils suitable for mouse brain imaging |
Animal monitoring and gating equipment | SA Instruments, Stony Brook, New York, USA | 22124005 | MRI compatible temperature and respiration monitoring |
Bupivacaine | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 512345 | Marcaine |
C57BL/6 Mice | Charles River, Oxford, UK | B6JSIMA49D | |
Carprofen | Norbrook Laboratories | 143658 | Carprieve 5% w/v Small animal solution for injection |
Chlorhexidine 4% hand cleanser solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | MOLN10008780 | HibiScrub Antimicrobial hand cleanser, Molnlycke Health Care |
Cotton buds | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 213512 | Any plastic body, cotton bud tip are suitable once made sterile by autoclaving. |
Dissecting stereoscope | Carl Zeiss | OPMI99 | Resident piece of equipment. Any binocular dissecting stereoscope capable of x1-x5 magnification will be suitable. |
dissolvable 6-0 sutures | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 9544 | Absorbable Sutures Ethicon Coated Vicryl 6/0 (Ethicon code: W9981) |
Donut probe holder | Moor Instruments, UK | PHDO | Probe holder for mouse, required to be used with single fibre optic probe when used with laser doppler flowmtry machine. |
dumont #5 forceps | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 500342 | |
Fibrinogen and thrombin sealant | Baxter, Berkshire, UK | 1502243 | TISSEEL Ready to use solutions for Sealant 2ml |
Gel food | Datesand group, Manchester, UK | 72065022 | Diet Gel Recovery |
Image display and measuring software package | 3D Slicer | https://www.slicer.org/ | Version 4.0 |
Image display and measuring software package | NIH, Maryland, USA | https://imagej.nih.gov/ij/index.html | NIH/ImageJ |
LDF monitor | Moor Instruments, UK | moorVMS-LDF | |
micro vannas scissors | InterFocus Ltd, Linton, UK | 15000-08 | Other microvannas spring scissors can be used as an alternative, although fine tips are required. |
Microvascular clip | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 15911 | 10 G Vessel Clip |
microvascular clip holders | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 14189 | |
MRI acquisition and analysis software | Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA | VnmrJ Version 4.2 | Revision A |
no. 15 scalpel | Scientific Laboratory Supplies, Nottingham, UK | INS4678 | Sterile No15 Scalpel – manufactuer number P305. Other suppliers are available. |
Non-disolvable 6-0 suture | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | W529 | Ethicon Mersilk Sutures |
Ocular lubricant | National Veterinary Services, Stoke-on-trent, UK | 847288 | Lacrilube (5100G13) |
Optical matching gel | Moor Instruments, UK | PMG | |
Pulse Oximetry Reader | Starr Life Sciences Corp., Oakmont, PA, USA | MouseOx | MouseOx – rat & mouse pulse oximeter & physiological monitor Use with mouse thigh sensor. |
Rehydration gel | Datesand group, Manchester, UK | 70015022 | HydroGel |
Small hair clippers | vetproductsuk.com | HS61 | Contura Cordless trimmer/clippers |
Sterile 0.9 % NaCl Solution | VWR International Ltd, Lutterworth, UK |
LOCA3528286 | SODIUM CHLORIDE 0.9% W/V INTRAVENOUS INFUSION BP 500 ML IN ECOFLAC½ PLUS |
sterile petri dish | VWR International Ltd, Lutterworth, UK | 5168021 | 50mm sterile petri dish. Any brand is suitable. Minimum 50mm diameter is required. |
Topical tissue adhesive | World Precision Instruments, Hertfordshire, UK | 503763 | GLUture topical Tissue Adhesive |
Waterproof superglue | Loctite | Loctite Superglue Precision Max | Available at most hardware shops. |
White paper chip | Datesand group, Manchester, UK | CS1BPB | Pure-O'Cel |