הביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana טבק העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים. בזאת הוא תיאר נוהל מפורט לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה (5 ימים) של triterpenes, תחליפי ניצול פלטפורמה חזקה זו מבוססת על צמחים.
Triterpenes הם אחד מהגדולים רוב המשפחות מגוונות מבחינה מבנית של מוצרים טבעיים מהצומח. רבים נגזרים טריטרפן הוכחו בעלי פעילות ביולוגית רלוונטית מסיבות בריאותיות. עם זאת, עד כה פוטנציאל זה לא תורגמה שפע של סמים נגזר טריטרפן במרפאה. . זה ניתן לטעון (לפחות חלקית) תוצאה של גישה מוגבלת סינתטי מעשי ברמה זו של המתחם, בעיה אשר יכולים להחניק חקר מבנה-פעילות הגומלין ופיתוח של עופרת מועמדים על ידי מסורתי מרפא כימיה זרימות עבודה. למרות המגוון העצום שלהם, triterpenes כל נגזרים מתוך הקדמה ליניארי יחיד, 2, 3-oxidosqualene. ביטוי heterologous ארעי של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר benthamiana ש להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים בעלי ערך גבוה טריטרפן חדשים לא המיוצרים באופן טבעי על-ידי מחשב מארח זה. אגרו-חדירה הוא אמצעי יעיל ופשוט של השגת ביטוי benthamiana שארעית. התהליך כרוך חדירה של צמח עלים עם השעיה של Agrobacterium tumefaciens נושאת את construct(s) ביטוי של עניין. הסתננות שותף נוסף tumefaciens א זן נושאת לבנות ביטוי קידוד מגבירה את אנזים זה מגביר אספקת קודמן באופן משמעותי את התשואות. לאחר תקופה של חמישה ימים, החומר העלה הסתנן ניתן לקצור ולעבד לחלץ ולבודד את המוצר טריטרפן וכתוצאה מכך. זהו תהליך זה באופן ליניארי ובאמינות מדרגיים, פשוט על ידי הגדלת מספר צמחים המשמשים את הניסוי. בזאת הוא תיאר פרוטוקול לייצור מיכשור וציוד בקנה מידה מהירה triterpenes ניצול פלטפורמה זו מבוססת על צמחים. הפרוטוקול מנצל מכשירים חדירה ואקום בקלות ניתן לשכפול, אשר מאפשר חדירה בו זמנית של עד ארבעה צמחים, ומאפשרת חדירה batch-wise של מאות צמחים בתקופה קצרה של זמן.
Triterpenes הם אחד מהגדולים רוב המשפחות מגוונות מבחינה מבנית של מוצרים טבעיים מהצומח. למרות המגוון העצום שלהם, כל המוצרים הטבעיים טריטרפן הסברה להיגזר את אותו קודמן לינארית 2, 3-oxidosqualene, תוצר של השביל mevalonate בצמחים. Cyclization של 2, 3-oxidosqualene יזם, נשלט על-ידי משפחה של אנזימים כינה oxidosqualene cyclases (OSCs). שלב זה cyclization מייצג את הרמה הראשונה של גיוון, עם מאות פיגומים טריטרפן שונים שיש דווחו טבע1. פיגומים אלו מגוונים נוספים על-ידי התאמת אנזימים כולל אך לא מוגבל, ציטוכרום p450s1,(CYP450s)2. מסלולים biosynthetic הוחלף נגזר כזה יכול להוביל מורכבות עצומה, לפעמים וכתוצאה מכך המוצרים הסופיים אשר בקושי לזיהוי מ טריטרפן האב. לדוגמה, מבנה מורכב אזדרכטין limonoid חזק של חרקים, antifeedant הוא האמין שואבים טריטרפן tetracyclic של tirucallane סוג3.
רבים נגזר טריטרפן מוצרי טבע, אפילו אלה עם האב יחסית שלא שונתה פיגומים, הוכחו בעלי פעילות ביולוגית רלוונטית מסיבות בריאותיות4,5,6,7. עם זאת, עד כה פוטנציאל זה לא תורגמה שפע של סמים נגזר טריטרפן במרפאה. . זה ניתן לטעון (לפחות חלקית) תוצאה של גישה מוגבלת סינתטי מעשי ברמה זו של המתחם, בעיה אשר יכולים להחניק חקר מבנה-פעילות הגומלין ופיתוח של עופרת מועמדים על ידי מסורתי מרפא כימיה זרימות עבודה.
הביטוי ארעית של אנזימים biosynthetic הוחלף נגזר טריטרפן ממינים אחרים צמח benthamiana ש העלים להסיט אספקה אנדוגני של 2, 3-oxidosqualene לעבר הייצור של מוצרים חדשים בעלי ערך גבוה טריטרפן (איור 1). תהליך זה יכול לשמש באופן פונקציונלי לאפיין את המועמד אנזימים, בנייה מחדש של מסלולים biosynthetic הוחלף נגזר של מטבוליטים חשובים המתרחשים באופן טבעי. באותה מידה, אפשר גם לנצל את זה ב biosynthetic הוחלף נגזר גישות קומבינטורית. לייצר מוצרים חדשניים טריטרפן, אסטרטגיה שיכול לגרום ספריות של תחליפי הקשורות מבנית, המאפשר חקר הקשרים מבנה-פעילות שיטתית מעופרת פעילים ביולוגית תרכובות8,9.
Agroinfiltration הוא אמצעי יעיל ופשוט של השגת ביטוי ארעי העלים benthamiana ש . התהליך כרוך החדירה של עלים עם השעיה של tumefaciens א נושאת את construct(s) בינארי ביטוי של עניין. זו מושגת באמצעות הפעלת לחץ שכופה את הנוזל דרך הפיוניות, האוויר במרחב המערכת, והחלפתו המתלה tumefaciens א . החיידק להעביר את T-DNAs בהתאמה הפנים של תאי הצמח, והתוצאה היא ביטוי חלבון מקומי ולא ארעית בתוך רקמת העלה הסתנן.
תוך כדי כל וקטור בינארי מתאימים עבור יצירת הצמחים הטרנסגניים עשוי להיות מועסק לביטוי ארעי, אנו מנצלים לוביה פסיפס וירוס CPMV, נגזר Hypertranslational (HT) חלבון ביטוי מערכת10, 11. במערכת זו הגן עניין משני צדדיה אזורים לא מתורגם (UTR) מ CPMV RNA-2. 5′ UTR מכיל שינויים וכתוצאה מכך רמות גבוהות מאוד של חלבון תרגום עם אין הסתמכות על שכפול ויראלי12. שיטה זו פותחה לתוך הסדרה וקטור בינארי קל ומהירה (pEAQ) הכוללת רקומבינציה בייעודי לאתר שיבוט תואם פרוטוקול בונה (pEAQ –HT– DEST)10,11. רוב pEAQ וקטורים מכילים גם עם עגבניות פעלולים בושי נגזר וירוס P19 שתיקה משתיק קול ג’ין13 בתוך החלק T-DNA בקלטת ביטוי, אשר עוקף את הצורך coinfiltrate זן P19 נושא נפרד, ונותנת לו מאוד ביטוי חלבון ברמה גבוהה במארח הצמח תא10,11.
שימוש benthamiana (ש ע) כמו מארח ביטוי יש יתרונות מסוימים בעת עבודה עם מסלולים biosynthetic הוחלף נגזר הצמח. הארכיטקטורה תא תומך מיסודו mRNA המתאים לעיבוד חלבון, ואת מידור תקין, בנוסף פו-טי של אנזימים הדרושים לעבודה, reductases (עבור CYP450s) ו מבשרי מטבולית. מקור הפחמן הוא הפוטוסינתזה; לפיכך, ניתן פשוט לגדל צמחים קומפוסט איכותי, המחייב רק מים, CO2 (מן האוויר), ואור שמש כקלט. הפלטפורמה היא גם מאוד נוח עבור ביטוי משותף של צירופים שונים של חלבונים, כמו זה ניתן להשיג facilely באמצעות חדירה שיתוף של זנים שונים של tumefaciens א, שלילת הצורך לבנות ביטוי multigene הגדול יצורים עילאיים גדול קלטות. יתר על כן, התהליך וניתן באופן ליניארי ובאמינות לשנותם פשוט על-ידי הגדלת מספר צמחים המשמשים את הניסוי.
העבודות הקודמות במעבדה שלנו הוכיחה את התועלת של הפלטפורמה עבור ניסויים בקנה מידה מפוח. זה כלל את הכנת triterpenes הרומן לשימוש אתריים מבחני בקנה מידה למעלה כדי להשיג גרם כמויות של מוצר בודד. יתר על כן, ניתן להגדיל הצטברות של מוצרים טריטרפן heterogenous כמה לקפל על ידי ביטוי משותף של טופס N-מסוף-קטום, משוב-רגישות של הידרוקסי 3, 3-methyglutary-קואנזים רדוקטאז (tHMGR), הגבלת קצב נגד הזרם אנזים מסלול mevalonate8.
המפתח ניסויים מפוח בקנה מידה כזה הוא היכולת בנוחות עד בקנה מידה תהליך הסתננות. בניסוי טיפוסי, עשרות עד מאות צמחים עשוי להידרש כדי להשיג את המטרה כמות המוצר מבודד. הסתננות עלים בודדים באופן ידני (באמצעות מזרק מיותר) היא מבצעית תובעניים, וצורך לעתים קרובות מדי, עיבוד בשיטה זו מעשי עבור הסולם שגרתית. הסתננות ואקום מציעה יתרונות חדירה יד, הוא אינו תלוי רמת המיומנות של המפעיל ומאפשר החדירה של אזור רחב יותר של פני העלים. הליך זה משמש מסחרית לייצור בקנה מידה גדול של חלבונים התרופות14. פרוטוקול זה מנצל מכשירים חדירה ואקום בקלות ניתן לשכפול, אשר יכול להיות בנוי חלקים זמינים מסחרית. דבר זה מאפשר חדירה בו זמנית של עד 4 צמחים, מנקר מהירה ומעשית batch-wise חדירה של מאות צמחים בתקופה קצרה של זמן (איור 2 א -2b). מנגנון ואקום הסתננות מורכב תנור ואקום המהווה תא חדירה (2f איור). התנור מחובר משאבה באמצעות מאגר ואקום. זה מפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי להשיג את הואקום הרצויה בבית הבליעה הסתננות. צמחים מאובטח ב בעל העידו והפכתי לתוך אמבט מים מפלדת 10 L מלא עם הבולם tumefaciens א (איור 2 א -2 c). טבילה מלאה חלקים אווירי של הצמחים חשוב חדירה יעיל. המים הרותחים הוכנסה בתוך תא חדירה (איור דו-ממדי -2e), את ואקום להחיל כדי לצייר את האוויר מתוך הרווחים interstitial עלה. ברגע הלחץ הופחת 880 mbar (תהליך אשר לוקח כ 1 דקות) תא הסתננות הוא החזיר במהירות הלחץ האטמוספרי 20-30 s על-ידי פתיחת שסתום כניסת את התנור, ואז חדירה הושלם.
חמישה ימים לאחר חדירה חומר צמחי מוכן עבור חילוץ האיסוף ובעקבות ובידוד של המוצר הרצוי. מנקודה זו התהליך הוא פשוט אחד מוצר טבעי מיצוי וטיהור מחומר עלה, זרימת עבודה המוכרת כל כימאי מוצר טבעי. שיטות שונות רבות הראשונית מיצוי וטיהור הבאים קיימים15. הבחירה המתאימה ביותר של שיטות בדיוק את אותם התנאים בשימוש תלויה מאוד התכונות הכימיות מסוים של המתחם של עניין, בנוסף זמינותו של מיומנויות ו/או ציוד. . זה לא ניתן לכלול בפרוטוקול זה שיטה להכליל באופן מלא, שלב אחר שלב העיבוד במורד הזרם של חומר צמחי שנקטפו עלה על מוצר בודד יכול להיות אחריו באופן עיוור על כל מוצר טריטרפן עניין, וגם זה יהיה מתאים כדי לנסות לעשות זאת. עם זאת, פרוטוקול זה יספק סקירה כללית של העבודה הבסיסי בשימוש המעבדה שלנו כמה שיטות בשלבים המוקדמים של התהליך, אשר מניסיוננו הוכיחו להכליל למוצרים טריטרפן אגליקון ביותר מחומצן. זה כולל שתי טכניקות נדיר יחסית, כלומר, חילוץ הממס בלחץ (פסי), ו שיטה נוחה שלב heterogenous להסרת כלורופיל באמצעות שרף יונים בסיסיים מאוד.
פסי היא טכניקה יעילה במיוחד לצורך הוצאת מולקולות אורגניות קטן ממטריצות מוצק. עקירות נעשות תחת לחץ (ca. 100-200 bar), היתרון העיקרי להיות היכולת להשתמש להקלה טמפרטורות אשר חורגים הרתיחה הצבע של הממס החילוץ. זה יכול להפחית באופן משמעותי את הזמן ואת כמות הממס הדרוש להשגת הוצאה ממצה, לעומת טכניקות אחרות ממס חם כגון refluxing פשוטה או עקירות Soxhlet16. מסחרי ספסל-העליון PSE כלים זמינים, אשר לנצל את תאי החילוץ להחלפה, הממס אוטומטיות טיפול חימום, ניטור. זה הופך את הטכניקה הזו מאוד נוח. . זה גם ניתן לטעון מסוכנים פחות, במיוחד עבור אופרטורים בעלי ניסיון בכימיה המעשית מוגבלת.
סיבון של תמציות עלה גולמי תחת ריפלוקס ואחריו נוזלי/נוזל למחיצות היא טכניקה נפוצה להסרת בצובר chlorophylls לפני טיהור עוקבות או ניתוח. עם זאת, זה לעיתים קרובות מבצעית דורשת הרבה על סולמות גדול יותר. יתר על כן, זיהוי של ממשק או אובדן המוצר עקב היווצרות של אמולסיות יכול להיות בעייתי. השימוש בחום בסיסי חילוף יונים-שרפים לבצע הידרוליזה heterogenous שלב יכול לשמש כתחליף נוח. החלק פיגמנט של כלורופיל הידרוליזה נשאר מודבקת שרף, ו ניתן להסיר רק באמצעות סינון. פרוטוקול זה מנצל עיבוד מפוח בקנה מידה של ההליך האנליטי שדווחה בעבר17 מעסיקה שרף יונים בסיסיים זמינים מסחרית.
להלן נתאר פרוטוקול מפורט, מהיר ומדויק לייצור בקנה מידה מפוח triterpenes ניצול פלטפורמה זו מבוססת על צמחים. פרוטוקול זה משמש באופן שגרתי במעבדה שלנו כדי להכין עשרות למאות מיליגרם של המוצר טריטרפן מבודדים עבור יישומים כגון אפיון מבניים על-ידי תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה ו / או המשך מחקר בפונקציונלי מבחני.
הסתננות ואקום גבוה-דרך-הניח מאפשרת פרוטוקול זה לשמש באופן שגרתי במעבדה שלנו לייצור מיכשור וציוד של תרכובות טריטרפן עניין ליישומים שונים במורד הזרם. מנגנון ואקום הסתננות המתוארים כאן בקלות משוכפלת. תוספת של המאגר ואקום, מומלץ להקטין את הזמן הנדרש כדי למשוך את הואקום הכרחי, אולם ניתן פשוט מחדש תנור ואקום יאומתו כמו תא הסתננות. הגנה על משאבת ואקום באמצעות תוספת של הקבל מתאימים תיאורטית הגיונית, אבל במעבדה שלנו אנחנו גילינו שזה יהיה מיותר.
כיסוי הסתננות בסכנה אם העלים לא שקועים לחלוטין ההשעיה הסתננות. בעיה זו ממוזער על-ידי הבטחת כי הרמה של המתלה מגיע לפני השטח העליון של בעל המפעל, כי בעל המפעל הוא צר על האמבטיה הסתננות. הערה מאיור 2 כי המשטח העליון של בעל המפעל שקוע לאמבטיה הסתננות כאשר במקום. זו מושגת על ידי פאנלים על הקצוות האמצעי של בעל אשר מהווים נקודת העיגון עם החלק העליון של האמבטיה הסתננות. המתלה הסתננות יחייב תוספות תקופתיים כדי לשמור על רמת ההשעיה. זו מושגת בצורה הטובה ביותר על ידי תוספת של חדירת עודפי ההשעיה כדי למנוע צמצום הדרגתי של ה OD600 במהלך החדירה batch-wise גדול. עם זאת, בידיים שלנו, החלפת מים לא נראה יש השפעה ניכרת על התשואות הצפויה בקנה מידה מפוח, אמנם זה לא היה quantitively חקר. ועמדו להסתנן כמה צמחים של אצווה אחת של הסתננות ההשעיה היא עדיין שאלה פתוחה. אנחנו באופן שגרתי לחדור בין צמחים 100 ו-200 עם אצווה בודדת של הסתננות ההשעיה. בנוסף, זה נורמלי עבור אדמה תסנן לתוך ההשעיה חדירה במהלך תהליך הסתננות. זה לא נמצאה השפעה ניכרת על הסתננות היעילות.
במשך הקציר. זה רצוי (אך לא קריטית) כדי לקצור רק העלים היו שחדרו (כמה עלים תהיה גדול שלאחר חדירה). בציר סלקטיבי מונע דילול עם רקמת יצרנית, אשר אחרת להגביר את היחס של זיהומים אנדוגניים יחסית למתחם של ריבית. זה יש השפעה הנומינלית על הקלות של טיהור במורד הזרם ומגביר את קנה המידה של תהליכים אלה. בעת שימוש tHMGR כדי להגביר את אספקת קודמן, הפנוטיפ necrosed נצפית לעיתים קרובות לפתח על התקופה שלאחר הסתננות צמיחה. זה נורמלי, למעשה מסייע בציר סלקטיבי, תהליך הייבוש במורד הזרם. ניתן לאחסן את האבקה עלים יבשים בדרך כלל במיכל אטום במקום קריר, יבש, חשוך, אבל באופן אידיאלי desiccator תחת ואקום. זה תלוי היציבות של המתחם של עניין. לנקוט זהירות אם בוחר לאחסן במקפיא-80 ° C. להבטיח את יבשים העלים הם במיכל עמיד למים, על הסרה של אחסון, לאפשר את המכל כדי לחמם לטמפרטורת החדר לפני הפתיחה. כך תגרום rewetting של העלים, הפרעה עיבוד מטה-stream.
השלבים שלאחר הקציר של פרוטוקול זה ניתנים להמחשה, וניסיון כדי לסייע החוקרים האלה תהיה מוגבלת כימיה מעשית. הם הרבה מכדי רבים טכניקות החילוץ/טיהור אחרות מוצר טבעי. כמפורט במבוא, פסי יתרונות רבים, אולם הבירה עלות המנגנון PSE זמינים מסחרית ייתכן שהעלות ולאחר זה לא חיוני. טיפול בסיסי חילוף יונים-שרף היא שיטה מאוד נוח להחליף המסורתי סיבון ואחריו נוזלי/נוזל למחיצות. עם זאת, היא לא מתאימה עבור מוצרים המכילים חומצה קרבוקסילית קבוצות או קבוצות פונקציונליות זה הידרוליזה בתנאים בסיסיים, כגון אסטרים. מוצרים אלה יהיה צפוי יישמרו על שרף חילוף יונים בסיסיים. עם זאת, יש פוטנציאל לנצל את זה עבור לכידה, לשחרר את ההליך (לא מתועדים כאן). איפה סיבון מסורתי יהיה הולם, טיפול בסיסי חילוף יונים-שרף מגישה כתחליף נוח. כבר מצאו את שיטת כרומטוגרפיה שמתואר בשלב 9, ניתן להכליל עבור תרכובות המתואר באיור3. עם זאת, תרכובות של קוטביות מוגברת עשוי לדרוש 100% אתיל אצטט • תנאי תקופה ארוכה. התייחסות צעד 9.2, טיהור בסדר במורד הזרם הוא ספציפי מורכבים לחלוטין, הוא גם תלוי בקנה מידה. סיבובים חוזרים ונשנים של כרומטוגרפיה פלאש מידה קטן יותר עם מעברי צבע ממוטב, מספיקה בדרך כלל להשגת טוהר המתאים לניתוח NMR. על קשקשים גדולים, התגבשות לעתים קרובות חלופה נוחה. במקרים קשים, מפוח או מפוח למחצה ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) יכול להיות מועסק בהתאם לכמות הרצויה של המתחם מבודד. דוגמאות של תהליכי טיהור במורד הזרם עבור מגוון של תרכובות נציג ניתן למצוא במקום8.
בפרוטוקול הנוכחי, כפי שהוצג כאן, משמש באופן שגרתי במעבדה שלנו, הוכיח את השירות. עם זאת, ישנו טווח עדיין משמעותיים נוספים מיטוב של פלטפורמת הביטוי. עבודה מתמשכת במעבדה שלנו לחקור איך נוסף מסלול הנדסה, שליטה דיפרנציאלית על רמות ביטוי החלבון יכול לשפר טריטרפן הפקה נוספת, תוך תיווכה רעילות לתאים המארח. יש גם פוטנציאל לחקור המניפולציה של20,של מערכות תחבורה תאיים21, הכיוון של אנזימים תאים סלולריים שונים22,23, השדרות אשר יכול לשפר היעילות של אירועי חמצון מרובים. גם ניתן לסייר היתרונות הפוטנציאליים לפעילות שינוי המבנה הבסיסי של organelles מפתח. לדוגמה, ביטוי של התחום ממברנה של תודרנית לבנה HMGR נצפתה לזירוז היפרטרופיה של רשתית תוך-פלזמית צמחים24; אתר המפתח לפעילות CYP450. פרוטוקול זה הוא אידיאלי עבור הייצור של מיליגרם ל בקנה מידה גרם כמויות של מוצרים טריטרפן, יכול להיות מועסק במסגרת מחקר כדי לגשת תרכובות למחקר במורד הזרם (למשל, חקר מבנה-פעילות שיטתית קשרי הגומלין ולאחר חקירות ראשוני למאפיינים pharmacodynamic ו פרמוקוקינטיים של אחרים-ריאקטיבים עניין קליניים). עם זאת, הפלטפורמה היא לינארית, באופן אמין ומדרגי פשוט על-ידי הגדלת מספר צמחים בשימוש, ומעשיות של ביטוי חולף דרך agroinfiltration הוכח בקנה מידה תעשייתי לייצור של חלבונים התרופות 14, לפיכך יש פוטנציאל עבור הפלטפורמה שיורחבו לייצור מסחרי של triterpenes בעלי ערך גבוה. לחלופין, זה גם אפשרי לדמיין את הייצור של transformants יציב נושאת את המעבר biosynthetic הוחלף נגזר multigene הגדול יצורים עילאיים הרצון גיבוש, המאפשר גידול המוני והמשיך “חקלאות” של הטרנסגניים benthamiana ש זנים ייצור תרכובות שונות של ערך מסחרי.
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי נוריץ מחקר פארק Studentship (הבן), הנדסת הג’וינט ואת המועצה מחקר מדעי/Biotechnological במימון מחקר מדעי ביולוגי, המועצה BBSRC OpenPlant סינתטי ביולוגיה המרכז לחקר הענק (BB / L014130/1) (M.J.S., ואחרות); ג’ון אינס מרכז הידע Exchange ומסחור הענק (BB/KEC1740/1) (בי); ואת המענק תוכנית אסטרטגית BBSRC מכון ‘מולקולות מן הטבע’ (BB/P012523/1) וקרן ג’ון אינס (ואחרות). ברצוננו להודות ג’ורג Lomonossoff למתן את הווקטורים pEAQ אנדרו דייוויס לצילום.
GC-MS instrument | any | n/a | |
Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
Standing incubator | any | n/a | |
Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
Balance (2 figures) | any | n/a | |
Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
A -80 freezer | any | n/a | |
Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
Safety glasses | any | n/a | |
Lab coat | any | n/a | |
Autoclave | any | n/a | |
Consumables | |||
Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
Reagents | |||
Quartz sand, 0.3 – 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
Ethanol | VWR | 20821-330 | |
Milli-Q water | any | n/a | |
Levington F1 Compost | any | n/a | |
Levington F2 Compost | any | n/a | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
GATEWAY BP CLONASE ™ II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |