Voorbijgaande heterologe expressie van biosynthetic enzymen in Nicotiana benthamiana bladeren kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe producten van hoogwaardige triterpene. Hierin is beschreven van een gedetailleerd protocol voor snelle (5 dagen) preparative-schaal productie van triterpenen en analogen met behulp van dit krachtige plantaardige platform.
De triterpenen zijn één van de grootste en meeste structureel diverse families van plantaardige natuurlijke producten. Groot aantal afgeleiden van de triterpene hebben aangetoond dat medisch relevante biologische activiteit bezitten. Echter heeft dit potentieel tot nu toe niet vertaald in een overvloed van triterpene afkomstige drugs in de kliniek. Dit is aantoonbaar (op zijn minst gedeeltelijk) een gevolg van de beperkte praktische synthetische toegang tot deze klasse van stof, een probleem dat de exploratie van structuur-activiteit verhoudingen en ontwikkeling van verstikken kan kandidaten door traditionele geneeskrachtige leiden chemie werkstromen. Ondanks hun enorme diversiteit, triterpenen zijn allen afgeleid van een enkele lineaire voorloper, 2,3-oxidosqualene. Voorbijgaande heterologe expressie van biosynthetic enzymen in de N. benthamiana kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe hoogwaardige triterpene producten die natuurlijk niet door deze host worden geproduceerd. Agro-infiltratie is een efficiënte en eenvoudige wijze van verwezenlijking van voorbijgaande expressie in N. benthamiana. Het proces omvat infiltratie van bladeren van de plant met een suspensie van Agrobacterium tumefaciens uitvoering de bedrijfsscholen expressie van belang. Co infiltratie van een extra A. tumefaciens stam uitvoering resulteert in een expressie construct codering een enzym dat verhoogt de voorloper aanbod aanzienlijk verhoogt. Na een periode van vijf dagen, kan het geïnfiltreerde blad materiaal worden geoogst en verwerkt om te halen en te isoleren van de resulterende triterpene product(en). Dit is een proces dat is lineair en betrouwbaar schaalbaar, simpelweg door het verhogen van het aantal planten gebruikt in het experiment. Hierin is beschreven van een protocol voor snelle preparative-schaal productie van triterpenen gebruik te maken van dit platform op basis van planten. Het protocol maakt gebruik van een gemakkelijk repliceerbaar vacuüm infiltratie-apparaat, waardoor de gelijktijdige infiltratie van maximaal vier planten, waardoor batch-wise infiltratie van honderden planten in een korte periode van tijd.
De triterpenen zijn één van de grootste en meeste structureel diverse families van plantaardige natuurlijke producten. Ondanks hun enorme diversiteit, worden alle triterpene-natuurproducten verondersteld te worden afgeleid uit de dezelfde lineaire voorloper 2,3-oxidosqualene, een product van de mevalonate-pathway in planten. Cyclisatie van 2,3-oxidosqualene is gestart en wordt beheerd door een familie van enzymen oxidosqualene cyclases (OSCs) genoemd. Het eerste niveau van diversificatie, vertegenwoordigt deze stap cyclisatie met honderden verschillende triterpene steigers van aard1hebben gemeld. Deze steigers zijn verder gediversifieerd door afstemming van enzymen waaronder, maar niet beperkt tot, cytochrome p450s (CYP450s)1,2. Dergelijke biosynthetic trajecten kunnen leiden tot immense complexiteit, soms resulterend in eindproducten die nauwelijks herkenbaar uit de bovenliggende triterpene. Bijvoorbeeld, wordt de complexe structuur van de krachtige insecticide en antifeedant limonoïde-azadirachtin verondersteld te ontlenen aan een triterpene van de tetracyclic van de tirucallane type3.
Vele triterpene bereide natuurlijke producten, zelfs degenen met relatief ongewijzigde bovenliggende steigers, hebben aangetoond dat het bezitten van medisch relevante biologische activiteit4,,5,,6,7. Echter heeft dit potentieel tot nu toe niet vertaald in een overvloed van triterpene afkomstige drugs in de kliniek. Dit is aantoonbaar (op zijn minst gedeeltelijk) een gevolg van de beperkte praktische synthetische toegang tot deze klasse van stof, een probleem dat de exploratie van structuur-activiteit verhoudingen en ontwikkeling van verstikken kan kandidaten door traditionele geneeskrachtige leiden chemie werkstromen.
Voorbijgaande expressie triterpene biosynthetic enzymen uit andere plantensoorten in N. benthamiana bladeren kunt doorschakelen endogene leveringen van 2,3-oxidosqualene op de productie van nieuwe hoogwaardige triterpene producten (Figuur 1). Dit proces kan worden gebruikt voor functioneel karakteriseren kandidaat-enzymen en reconstrueren van de biosynthetic trajecten van belangrijk natuurlijk voorkomende metabolieten. Ook kan het ook worden benut in combinatorische biosynthetic benaderingen om nieuwe triterpene producten, een strategie die in bibliotheken van structureel verwante analogen resulteren kan, waardoor systematische verkenning van de structuur-activiteit verhoudingen te produceren verbindingen van biologisch actieve lood8,9.
Agroinfiltration is een efficiënte en eenvoudige wijze van verwezenlijking van voorbijgaande expressie in N. benthamiana bladeren. Het proces omvat de infiltratie van bladeren met een suspensie van A. tumefaciens uitvoering de bedrijfsscholen binaire expressie van belang. Dit wordt bereikt via de toepassing van druk waardoor de vloeistof via de stoma, lucht in de intercellulaire ruimte verdringt, en te vervangen met de A. tumefaciens schorsing. De bacteriën worden de respectieve T-Ani overbrengen in het interieur van de plantencellen, resulterend in gelokaliseerde en voorbijgaande eiwituitdrukking in het weefsel geïnfiltreerde blad.
Terwijl elke binaire vector geschikt voor het genereren van transgene planten kan worden gebruikt voor tijdelijke expressie, gebruiken we de Cowpea Mosaic Virus CPMV afkomstige Hypertranslational (HT) eiwit expressie systeem10, 11. in dit systeem het gen van belang wordt geflankeerd door niet-vertaalde regio’s (UTR) uit het CPMV RNA-2. De 5′ UTR bevat wijzigingen wat resulteert in zeer hoge niveaus van proteïne vertaling met geen afhankelijkheid van virale replicatie12. Deze techniek heeft ontwikkeld tot de Easy-en-Quick (pEAQ) binaire vector serie waarin site-specifieke recombinatie klonen protocol-compatibele constructies (pEAQ –HT– DEST)10,11. Meeste pEAQ vectoren bevatten ook een tomaat borstelige stunt virus afkomstige P19 silencing suppressor gen13 binnen het T-DNA-gedeelte van de expressie cassette, die de noodzaak om een aparte P19-uitvoering stam coinfiltrate omzeilt en biedt zeer op hoog niveau eiwituitdrukking in de ontvangende plant cel10,11.
Gebruik van N. benthamiana als een expressie-host bepaalde voordelen heeft bij het werken met plant biosynthetic trajecten. De cel-architectuur ondersteunt intrinsiek passende mRNA en verwerking van eiwitten en goede brandcompartimentering, naast de noodzakelijke co-enzymen, reductases (voor CYP450s) en metabole precursoren. De koolstofbron is fotosynthese; aldus, kunnen de planten gewoon in goede kwaliteit compost, waarbij alleen water, CO2 (vanuit de lucht), en zonlicht als input worden gekweekt. Het platform is ook zeer handig voor co uitdrukking van verschillende combinaties van eiwitten, zoals dit facilely kan worden bereikt door de co infiltratie van verschillende stammen van A. tumefaciens, ontkenning van de noodzaak om te bouwen van grote multigene expressie -cassettes. Bovendien, het proces kan worden lineair en betrouwbaar aangepast gewoon door het verhogen van het aantal planten gebruikt in het experiment.
Eerdere werkzaamheden in ons laboratorium heeft het nut van dit platform voor voorbereidende schaal experimenten aangetoond. Dit opgenomen de voorbereiding van nieuwe triterpenen voor gebruik in topicale testen en schaal tot en met het bereiken van gram hoeveelheden van geïsoleerde product. Bovendien, de accumulatie van heterogene triterpene producten kan worden verhoogd verschillende vouwen door co uitdrukking van de vorm van een N-terminal-afgekapt, feedback-ongevoelig voor 3-hydroxy-, 3-methyglutary-co-enzym een reductase (tHMGR), een snelheidsbeperking upstream enzym in de mevalonate route8.
Sleutel tot dergelijke experimenten preparative-schaal is de mogelijkheid om een gunstige up-schaal de infiltratie-proces. In een typisch experiment, tientallen tot honderden van planten mogelijk moet bereiken de doelgroep hoeveelheid geïsoleerde product. Infiltrerend individuele bladeren met de hand (met behulp van een onnodig spuit) is operationeel veeleisende, en vaak onbetaalbaar tijdrovend, waardoor deze methode onpraktisch voor routine schaal-up. Vacuüm infiltratie biedt voordelen ten opzichte van de infiltratie van de hand, het is niet afhankelijk van het vaardigheidsniveau van de exploitant en de infiltratie van een grotere ruimte van het blad oppervlak laat. Deze procedure is commercieel gebruikt voor de grootschalige productie van farmaceutische eiwitten14. Dit protocol maakt gebruik van een gemakkelijk repliceerbaar vacuüm infiltratie-apparaat, die kan worden opgebouwd uit onderdelen die commercieel verkrijgbaar. Hierdoor is de gelijktijdige infiltratie van maximaal 4 planten, bieden snelle en praktische batch-wise infiltratie van honderden planten in een korte periode van tijd (Figuur 2a -2b). Het vacuüm infiltratie apparaat bestaat uit een vacuüm oven die de infiltratie kamer (figuur 2f vormt). De oven is verbonden met een pomp via een vacuüm reservoir. Dit vermindert de tijd die nodig is om de gewenste vacuüm in de zaal van de infiltratie. Planten zijn beveiligd in een op maat gemaakte houder en ondersteboven in een 10 L roestvrij stalen waterbad gevuld met A. tumefaciens schorsing (Figuur 2a -2 c). Volledige onderdompeling van de antenne delen van de planten is belangrijk voor efficiënte infiltratie. Het waterbad wordt dan geplaatst in de vergaderzaal van de infiltratie (figuur 2d -2e), en het vacuüm toegepast om te tekenen van de lucht uit de interstitiële ruimten van blad. Zodra de druk verminderd met 880 mbar (een proces dat duurt ongeveer 1 minuut) de infiltratie kamer aan atmosferische druk snel terug is gebracht 20-30 s door het openen van de oven ingangsafsluiter, waarna infiltratie is voltooid.
Vijf dagen na de infiltratie is het plantmateriaal klaar voor de oogst en de daaropvolgende extractie en isolatie van het/de gewenste product(en). Vanaf dit punt is het proces gewoon een natuurproduct extractie en zuivering van blad materiaal, een werkstroom die is bekend bij elke scheikundige natuurproduct. Er bestaan veel verschillende methoden voor de eerste extractie en zuivering van de daaropvolgende15. De meest geschikte keuze van methoden en de exacte voorwaarden gebruikt is sterk afhankelijk van de bijzondere chemische eigenschappen van de stof van belang, naast de beschikbaarheid van vaardigheden en/of apparatuur. Het is niet mogelijk om op te nemen in dit protocol een volledig gegeneraliseerd, stapsgewijze methode voor de downstream verwerking van geoogste blad plantmateriaal voor geïsoleerde product die blindelings kan worden gevolgd voor elk product van de triterpene van belang, noch zou het geschikt om te proberen om dit te doen. Dit protocol zal evenwel een overzicht van de Basiswerkstroom gebruikt in ons laboratorium en sommige methoden voor de vroege stadia van het proces, die in onze ervaring is gebleken dat generaliseerbaar voor meest zuurstofrijk aglyconen triterpene producten. Het gaat hierbij om twee relatief zeldzaam technieken, namelijk drukkend Solvent extractie (PSE), en een handige heterogene fase methode voor chlorofyl verwijderen met behulp van een sterk basische ionenwisseling hars.
PSE is een zeer efficiënte techniek voor de winning van kleine organische moleculen uit solide matrices. Extracties worden uitgevoerd onder druk (ca. 100-200 bar), het belangrijkste voordeel is de mogelijkheid om het gebruik van verlicht temperaturen die hoger zijn dan het koken punt van de extractievloeistof. Dit kan aanzienlijk verminderen de tijd en de hoeveelheid oplosmiddel die nodig is om een uitputtende extractie, in vergelijking met andere hete oplosmiddel technieken zoals eenvoudige maagzuur of Soxhlet extracties16. Commerciële bank-top PSE-instrumenten zijn beschikbaar, die gebruikmaken van verwisselbare extractie cellen en geautomatiseerde oplosmiddel behandeling, Verwarming en toezicht. Dit maakt deze techniek zeer geschikt. Het is ook duidelijk minder gevaarlijk, vooral voor exploitanten met een beperkte praktische chemie ervaring.
Verzeping van extracten van de ruwe blad onder terugvloeiing gevolgd door vloeistof/vloeistof partitioneren is een gemeenschappelijke techniek voor de verwijdering van de bulk van chlorofylen voorafgaand aan latere zuivering of analyse. Echter, dit kan vaak worden operationeel eisen op grotere schalen. Bovendien kunnen detectie voor de interface, of verlies van de producten als gevolg van de vorming van emulsies problematisch zijn. Het gebruik van sterk basische ionenwisselaars uitvoeren van heterogene fase hydrolyse kan dienen als een geschikt alternatief. De gepigmenteerde gedeelte van de gehydrolyseerde chlorofyl blijft zelfklevend aan de hars en kan eenvoudig worden verwijderd door filtratie. Dit protocol maakt gebruik van een voorbereidende schaal aanpassing van een eerder gemelde analytische procedure17 die gebruikmaakt van een commercieel beschikbare fundamentele ionenwisseling hars.
Hieronder beschrijven we een gedetailleerde en snelle protocol voor de productie van de voorbereidende schaal van triterpenen gebruik te maken van dit platform op basis van planten. Dit protocol is routinematig gebruikt in ons laboratorium voor bereiden tientallen tot honderden milligrammen van geïsoleerde triterpene product voor toepassingen die een structurele karakterisering met nucleaire magnetische resonantie (NMR), infraroodspectroscopie, en/of verder studeren in functionele testen.
Hoog-via-gezette vacuüm infiltratie kan dit protocol worden routinematig gebruikt in ons laboratorium preparatieve voordeproductie van triterpene verbindingen van belang voor diverse downstream toepassingen. De hier beschreven vacuüm infiltratie-apparaat is gemakkelijk gerepliceerd. Toevoeging van het vacuüm reservoir is aan te raden om het verlagen van de benodigde tijd voor het trekken van het vereiste vacuüm, maar het is mogelijk om gewoon hergebruiken ongewijzigde vacuüm oven als de kamer van de infiltratie. Het beschermen van de vacuümpomp via de toevoeging van een geschikte condensor is theoretisch verstandig, maar in ons laboratorium hebben we gevonden dit overbodig.
Infiltratie dekking is aangetast als de bladeren zijn niet volledig ondergedompeld in de schorsing van de infiltratie. Dit probleem wordt geminimaliseerd door ervoor te zorgen dat het niveau van de suspensie bereikt de oppervlaktelaag van de houder van de plant, en dat de houder van de plant is een strakke pasvorm voor de infiltratie-bad. Opmerking van Figuur 2 dat de oppervlaktelaag van de houder van de plant is verzonken aan het bad van de infiltratie bij plaats. Dit wordt bereikt door de panelen op de middelste randen van de houder die vormen van het ankerpunt met de bovenkant van de infiltratie-bad. De infiltratie schorsing vergt periodieke aanvullingen op het peil van de schorsing. Dit is best bereikt door toevoeging van overtollige infiltratie opschorting om te voorkomen dat de geleidelijke vermindering van de OD600 in de loop van een grote batch-wise infiltratie. Echter in onze handen, doet vervanging voor water niet toelijken voor zijn een merkbaar effect op verwachte rendementen op preparatieve schaal, hoewel dit niet is geweest quantitively onderzocht. Hoeveel planten kunnen worden geïnfiltreerd van één partij van infiltratie schorsing is nog steeds een open vraag. We infiltreren routinematig tussen 100 en 200 planten met één enkele batch van infiltratie schorsing. Bovendien is het normaal dat sommige bodemmonster/uitspoelen naar de schorsing infiltratie in de loop van het proces van de infiltratie. Dit is niet een merkbaar effect op infiltratie werkzaamheid gevonden.
Tijdens de oogst is het aan te raden (maar niet kritisch) om te oogsten alleen de bladeren die waren geïnfiltreerd (enkele blaadjes zal zijn gegroeid na infiltratie). Selectieve oogst voorkomt verdunning met onproductieve weefsel, die anders de verhouding van endogene onzuiverheden ten opzichte van de compound van belang zou verhogen. Dit heeft een nominale invloed op het gemak van downstream zuivering, en verhoogt de omvang van deze processen. Bij het gebruik van tHMGR ter bevordering van de levering van de voorloper, wordt een necrosed fenotype vaak waargenomen te ontwikkelen in de groeiperiode na de infiltratie. Dit is normaal en het daadwerkelijk helpt selectieve oogst en het stroomafwaarts droogproces. Het gedroogde blad poeder kan meestal worden opgeslagen in een verzegelde container in een koele, droge, donkere plaats, maar idealiter in een exsiccator onder vacuüm. Dit hangt af van de stabiliteit van de stof van belanghebbende partijen. Wees voorzichtig als kiezen om op te slaan in een vriezer-80 ° C. Opdat de gedroogde bladeren zijn in een waterdichte container, en op de uitslag, toestaan deze container opwarmen tot kamertemperatuur voorafgaand aan de opening. Niet te doen zal resulteren in het rewetting van de bladeren, down-stream processing belemmeren.
De stappen na de oogst in dit protocol worden verschaft voor illustratieve doeleinden en steun die onderzoekers die praktische chemie beperkte mogelijk ervaring. Zij kunnen worden vervangen voor vele andere natuurproduct extractie/zuivering technieken. Zoals uiteengezet in de inleiding, PSE heeft vele voordelen, maar de hoofdstad kosten van verkrijgbare PSE-apparaat kan worden onbetaalbaar en het is niet noodzakelijk. Fundamentele ionenwisseling-hars behandeling is een zeer handige methode ter vervanging van de traditionele verzeping gevolgd door vloeistof/vloeistof partitioneren. Het is echter niet geschikt voor producten met carbonzuur of functionele groepen die zou worden gehydrolyseerd onder randvoorwaarden, zoals esters. Deze producten zou worden verwacht op de fundamentele ionenwisseling hars worden bewaard. Er is echter potentieel te exploiteren dit voor een vangst en de vrijgave procedure (niet gedocumenteerd hier). Waar traditionele verzeping wenselijk, fungeert fundamentele ionenwisseling-hars behandeling als een geschikt alternatief. De chromatografie-methode, beschreven in stap 9, geconstateerd worden gegeneraliseerd voor de verbindingen die zijn beschreven in Figuur 3. Verbindingen van verhoogde polariteit kunnen echter een langere periode van 100% ethylacetaat elutie. Met betrekking tot stap 9.2, stroomafwaarts fijne zuivering is volledig samengestelde specifiek, en is ook afhankelijk van de schaal. Herhaalde rondes van kleinschaliger flash chromatografie met geoptimaliseerde hellingen, is meestal voldoende om een passende NMR p.a. zuiverheid. Voor grotere schalen is kristallisatie vaak een handig alternatief. In moeilijke gevallen, kan de voorbereidende of semi-preparatieve krachtige vloeibare chromatografie (HPLC) afhankelijk van de gewenste hoeveelheid van geïsoleerde samengestelde worden toegepast. Voorbeelden van downstream zuivering processen voor een aantal representatieve verbindingen kunnen worden gevonden elders8.
Het huidige protocol, zoals hier gepresenteerd in ons laboratorium routinematig wordt gebruikt, en heeft bewezen nut. Er is echter nog aanzienlijke ruimte voor verdere optimalisatie van het platform van de expressie. Wordt gewerkt in ons laboratorium om te onderzoeken hoe verdere traject engineering en differentiële controle van expressie eiwitniveaus zou kunnen verbeteren triterpene productie verder, terwijl het bemiddelen van de toxiciteit voor de cellen van de gastheer. Er zijn ook mogelijkheden te onderzoeken van de manipulatie van intracellulair transport systemen20,21, en de richting van enzymen tot andere cellulaire compartimenten22,23, wegen die kunnen verbeteren de efficiëntie van meerdere oxidatie gebeurtenissen. Potentiële voordelen voor het wijzigen van de onderliggende morfologie van belangrijke organellen kunnen ook worden onderzocht. Bijvoorbeeld, heeft overexpressie van het domein van de membraan van Arabidopsis thaliana HMGR waargenomen voor het opwekken van hypertrofie van het endoplasmatisch reticulum in planten24; een belangrijke site voor CYP450 activiteit. Dit protocol is bij uitstek geschikt voor de productie van milligram naar gram-schaal hoeveelheden van triterpene producten, en in de instelling van een onderzoek kan worden gebruikt voor toegang tot compounds voor downstream studie (bijvoorbeeld, het systematische verkenning van structuur-activiteit relaties en vooronderzoek in naar de farmacodynamische en farmacokinetische eigenschappen van loodverbindingen van klinisch belang). Echter, het platform is lineair en betrouwbaar schaalbare gewoon door het verhogen van het aantal planten gebruikt, en de uitvoerbaarheid van voorbijgaande expressie via agroinfiltration is aangetoond op industriële schaal voor de productie van farmaceutische eiwitten 14, dus is er potentieel voor dit platform worden uitgebreid voor commerciële productie van hoogwaardige triterpenen. Als alternatief, is het ook mogelijk om de productie van stabiele transformants uitvoering van de multigene biosynthetic pathway gefinaliseerde verlangen, waardoor de massale teelt voor ogen en bleef ‘landbouw’ van transgene N. benthamiana stammen het produceren van verschillende stoffen met een handelswaarde.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door een Norwich Research Park studententijd (JR), verlenen de gezamenlijke Engineering en Physical Sciences Research Raad/Biotechnological en biologische wetenschappen onderzoek Raad BBSRC-gefinancierde OpenPlant synthetische biologie onderzoekscentrum (BB / L014130/1) (M.J.S., O.A.); een John Innes Centre kennisuitwisseling en commercialisering verlenen (BB/KEC1740/1) (BB); en de BBSRC Instituut strategisch programma subsidie ‘Moleculen uit de natuur’ (BB/P012523/1) en de John Innes Foundation (O.A.). We zouden graag bedanken George Lomonossoff voor het verstrekken van de pEAQ-vectoren en Andrew Davis voor fotografie.
GC-MS instrument | any | n/a | |
Thermocycler suitable for performing PCR reactions | any | n/a | |
Gel electrophoresis apparatus | any | n/a | |
Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L) | any | n/a | |
Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/> 15000 rpm) | any | n/a | |
Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/> 4000 rpm) | any | n/a | |
Standing incubator | any | n/a | |
Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L) | any | n/a | |
Centrifuge bottles (1 L) | any | n/a | |
Vacuum infiltration apparatus | bespoke | n/a | |
9 x 9 cm plant pots | any | n/a | |
Freeze drying apparatus (=/> 8 litre condenser capacity) | any | n/a | |
Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument) | Buchi | SpeedExtractor E-914 | |
Rotary evaporator apparatus | any | n/a | |
Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L) | any | n/a | |
Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L) | any | n/a | |
Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L) | any | n/a | |
Spatulas (assorted sizes) | any | n/a | |
Analytical balance (5 figures) | any | n/a | |
Balance (2 figures) | any | n/a | |
Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L) | any | n/a | |
A -80 freezer | any | n/a | |
Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument | Biotage | ISO-1EW | |
Safety glasses | any | n/a | |
Lab coat | any | n/a | |
Autoclave | any | n/a | |
Consumables | |||
Micropipette tips (Sizes : 1000 µL, 200 µL, 100 µL, 20 µL, 10 µL, and 2 µL ) | any | n/a | |
Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL) | any | n/a | |
Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL) | any | n/a | |
Disposable Transfer pipettes (size 2 mL) | any | n/a | |
Petri dishes (Size: 100 mL) | any | n/a | |
Biotage® SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges | Biotage | FSK0-1107-0100 | |
HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps | any | n/a | |
Disposable purple nitrile gloves | any | n/a | |
Top filter for E-914, cellulose | Buchi | 51249 | |
Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber | Buchi | 11055932 | |
Reagents | |||
Quartz sand, 0.3 – 0.9 mm | Buchi | 37689 | |
Celite 545 (diatomaceous earth) | Simga-Alrich | 22140-1KG-F | |
Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm) | Merck | 1.09385.5000 | |
2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid | Melford | B2002 | |
MgCl2 | Simga-Alrich | 208337-100G | |
KOH | Simga-Alrich | 60377-1KG | |
3’5’-dimethoxy-4’-acetophenone (acetosyringone) | Simga-Alrich | D134406-1G | |
Rifampicin | Alfa Aesar | J60836 | |
Kanamycin sulfate | Gibco | 11815-032 | |
Streptomycin | Simga-Alrich | S6501-100G | |
Gentamycin | MP biomedicals | 190057 | |
Agarose LE gel | Melford | MB1203 | |
LB broth Millar | Simga-Alrich | L3522-250G | |
Agar | Simga-Alrich | A5306-250G | |
NaCl | Simga-Alrich | S5886-500G | |
KCl | Simga-Alrich | P9541-500G | |
MgSO4.7H2O | Sigma-Alrich | M2773-500G | |
Glucose | Sigma-Alrich | G7021-100G | |
Ambersep® 900 hydroxide (basic ion exchange resin) | Sigma-Alrich | 06476-1KG | |
Hexane | Fisher | H/0406/PB17 | |
Ethyl acetate | Fisher | E/0900/PB17 | |
Dichloromethane | Fisher | D/1852/PB17 | |
Methanol | Fisher | M/4056/PB17 | |
Ethidium bromide | Sigma-Alrich | E7637-1G | |
Ethanol | VWR | 20821-330 | |
Milli-Q water | any | n/a | |
Levington F1 Compost | any | n/a | |
Levington F2 Compost | any | n/a | |
QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit). | Qiagen | 27104 | |
NEB 5-alpha Competent E. coli | Supplier New England Biolabs Ltd | C2987I | |
pEAQ-HT-DEST1 vector | Lomonossoff laboratory John Innes Center | n/a | |
pDONR207 | Thermo-Fisher | pDONR207 | |
A. tumefaciens LBA4404 | Thermo-Fisher | 18313015 | |
GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11791020 | |
GATEWAY BP CLONASE ™ II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol) | Thermo-Fisher | 11789020 | |
GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX | Promega UK Ltd | M7822 | |
PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE | New England Biolabs Ltd | M0530S | |
dNTP SET 100mm | Thermo-Fisher | 10297018 | |
RNEASY PLANT MINI KIT | Qiagen Ltd | 74904 | |
RQ1 RNASE-FREE DNASE | Promega UK Ltd | M6101 | |
Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System | Fisher | 10308632 | |
Trytone | Sigma-Alrich | T7293-250G | |
Nicotiana benthamiana seeds | any reputable supplier | n/a |