Yetişkin sıçan böbrek üzerinden olduğu gibi Glomeruli yalıtmak için verimli bir eleme yöntemi

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Pittsburgh Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. 1. yalıtım sıçan Glomeruli Steril % 1 yalıtım arabellek hazırlamak için 600 mL kabı Sığır serum albumin (BSA) 5 g ekleyin. 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x 500 mL kabı için ekleyin ve bir manyetik karıştırma çubuk ile tüm BSA eriyene kadar karıştırın. Steril filtre % 1 BSA/PBS arabellek bir hücre kültür Hood.Not: Steril % 1 BSA/PBS arabellek 4 ° C’de için bir hafta kadar tutulabilir. 2-4 Sprague-Dawley rat 150 ila 200 g ağırlığındaki elde edilir. Karbon dioksit inhalasyon yolu ile fareler dakikada Odası hacmi 10- oranında % 100 karbon dioksit tanıtıldı bir odası kullanarak ötenazi. Hayvanlar solunum kesilmesi için gözlemlemek ve karbon dioksit kaldırılması önce göz rengi solmuş. Cilt üzerinden % 70 etanol ile ön karın hazırlamak ve istenirse saç kesme makineleri saç, kaldırmak için kullanır. Bir ensizyon deri cerrahi makas veya skalpel kullanarak olun. Başka bir ensizyon iç organlar ortaya çıkarmak için kas katmanı yoluyla olun. Ötenazi, ikincil Yöntem olarak konumlanmıştır diyafram ve göğüs kemiği veya göğüs kafesi üzerinden kesi genişletir. İzole etmek ve her iki böbrek çıkarın ve 30 mL Hanks tamponlu tuz çözeltisi (HBSS) on Ice ile steril 50 mL Plastik Konik tüp içine yerleştirin.Not: Birkaç fareler aynı odada ötenazi ve böbrekler tümünün aynı konik tüp içinde yerleştirilebilir. Buz ve taşıma böbrekler steril hücre kültür kukuIeta tutun. HBSS, 5 mL buz, üzerinde de içeren bir steril Petri böbrekler aktarmak ve kaldırmak ve perirenal yağ makasa atmak ve forseps keskin. Hala varsa, ayrıca kaldırmak ve küçük bir yüzeysel kesik yaparak böbrek çevreleyen kapsül atın ve sonra yavaşça uzak organ çekin için keskin forseps kullanın.Not: Her zaman buz ve uygulama steril tekniği böbrek yalıtır tutun. Steril gazlı bez bir parça kabında böbrek düzenleme sırasında tutmak için dokulu yüzeyi olarak yerleştirilebilir. Böbrekler yarıya boyuna (midsagittal bölümü) ve kaldırmak ve (daha koyu renkte olan) medulla HBSS 5 mL ile ikinci bir Petri bir neşter ile atmak. Üçüncü bir Petri kabına HBSS 5 mL ile içine ağırlıklı olarak böbrek korteks vardır, geri kalan parçaları aktarmak ve steril bir tıraş bıçağı ile daha az 1 mm boyutunda adettir kadar veya bir hamur kurdu kadar kıyma. Üst ve alt kısımlarında % 1 ile 180 µm elek ıslak BSA/PBS üzerinden 500 mL Atık kabı. Protein ile elek kat ve verimi artıracak glomeruli bağlılık azaltır gibi kritik bir adımdır. Kıyılmış korteks elek küçük bir kenarına yerleştirin ve buz üzerinde oturan bir alt tava içine elek ile dokuyu ezme için bir 10 mL şırınga dokulu dalgıç flanş (kauçuk conta karşısında taraf) kullanın. HBSS ile düzenli olarak yıkayın ama numune dilüsyonu önlemek mümkün olduğu kadar az kullanın.Not: bir arabellek toplam, bu yüzden sadece 25 mL daha fazla burada kullanılabilir 30 mL fazla olamaz. Elek tek bir kenarında kıyılmış doku yerleştirmek için sebebi elek tercihan–dan tüm elek yüzey alanı parçası maruz sınırlayarak bağlılık glomeruli önlemektir. Bunu kolaylaştırmak için toplama elek durulama için alt tavada sıvı yeniden. Eleme işlemi tamamlandıktan sonra dikkatli bir şekilde bir kez daha % 1 BSA/PBS arabelleği alt gevşek yapıştırılır herhangi bir glomeruli yakalamak için Pan ile elek alt yıkayın. Tüm alt tavada sıvı içine birkaç 10 mL şırınga 20 G iğneler ile donatılmış toplamak ve en az 2 ek kez iğne geçer. Üzerinde son koleksiyon, glomeruli içeren sıvı şırıngada 90 µm elekten geçirmek için hazır kadar devam et. Sıvı şırıngalarda depolanır iken alt pan %1 BSA/PBS içine atık kabı ve ıslak üst ve alt kısımlarında % 1 ile 90 µm elek ile temizlenerek yıkama BSA/PBS. Elek üstünde tepe-in buz üzerinde alt tava koyun. Şırıngaları örnek olarak yukarıda tarif başka bir şırınga flanş ile elek ile elek ve lapa bir kenarına uygulayın. Her şey bir elek kenarında toplamak için alt pan çözümden yıkayın. Bir kez eleme tamamlandıktan, dikkatli bir şekilde olduğu gibi adım 1.5.1 Elek alt yıka. 50 mL Plastik Konik tüp alt tavada tüm sıvı toplamak. %1 BSA/PBS bir atık kabı ve ıslak üst ve alt kısımlarında %1 75 µm elek alt tavayla yıkama BSA/PBS. Elek üstünde tepe-in buz üzerinde alt tava koyun. Örnek bir elek kenarına uygulayın. Sıvı ile kolayca akışı gerekir. Durulama ile en az 20 mL % 1’lik üst aracılığıyla BSA/PBS Atık kabı içine. Dikkatle de elek alt yıkayın. Glomeruli bu 75 µm elek üstünde kalır. HBSS elek ile baş aşağı durulama tarafından glomeruli bir petri içinde toplamak için kullanın. Buraya kadar HBSS gerektiği gibi kullanın. Bir veya daha fazla 50 mL Plastik Konik tüpler buz üzerinde toplamak. Vasıl 1800 x g 4 ° C’de 5 dakika santrifüj kapasitesi, dikkatli bir pipet ile süpernatant kaldırmak ve Pelet 10 mL soğuk HBSS resuspend. Örnekleri dolduğunda birden çok konik Tüpler 1.7.2 içinde toplanmıştır. Santrifüjü adımı yineleyin. Glomeruli 5 mL HBSS sonraki adımdan devam etmek için hazır kadar resuspend. İstenirse, toplam glomeruli sayısı al. Bunun için bir pipet ile 10 µL örnek alıp açılan bir cam slayt üzerinde yerleştirin. Mikroskop altında görüntülemek, glomeruli alanında saymak ve toplam verim almak için 500 tarafından çarpın.Not: Saflık alanında görülen tübüllerin sayılması tarafından belirlenebilir ve yapıları glomeruli ve tübül toplam sayısına bölünmesi. Görme alanı > glomeruli olmalıdır. Önemli tübüler kirlenme ise aygıtlarından 1.6.1 ileriye ve ne zaman tamamlanıyor adım 1.7.1 iyice yıkayın emin olun. Bu adımdır içinde hangi borulu kirlenme olasılığı en yüksektir. 2. yaralanma Glomeruli Glomeruli 15 mL Plastik Konik tüp ve spin aşağı 200 x g. Resuspend böylece yaklaşık 9,000 glomeruli iyi başına toplam verim dayalı HBSS uygun bir miktarda toplamak. Örnek 450 µL 24-şey plaka her kuyuya pipet veya aşağı akım deneyleri uyan herhangi bir plaka biçim gerekli.Not: glomeruli tampon karıştırmak için yukarı ve aşağı Pipetting homojen bir çözüm sağlar. Glomeruli çok yapışkan ve ağır birbirlerine sopa ve bir çözüm alt kısmında hızlı ve tüp tarafı üzerine yerleşmek. (PS) çözüm sülfat 6 mg/mL protamine yapmak için ilk PS 1 g ile 40 ° C arasında 15 mL Plastik Konik tüp ve girdap iyice ısıtılan dH2O 10 mL içine geçiyoruz. Çözümün 30 µL alıp dH2O 470 µL için ekleyin.Not: Bu 6 mg/mL çözüm üretecek ve 50 µL eklendiğinde kuyuya aşağıda açıklandığı gibi son konsantrasyonu 0.6 mg/mL olur. Protamine sülfatın 50 µL yinelenen ekleyin (Bu 1:10 numara seyreltme) HBSS (negatif kontrol), başka bir grup 50 µL sağlama sırasında bir grup her şey. 4 h 37 ° C’de plaka kuluçkaya Her şey bir microcentrifuge tüp (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) içeriğini aşağı spin ve PBS her iki kez 1 mL ile yıkayın. Son yıkama Aspire edin ve PBS 300 µL içinde resuspend. Protein yalıtım, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) görselleştirme ve (varsa) boyama ayirt için hazırlanacak üç aliquots ayrılmıştır. 3. analiz için Glomeruli hazırlanması Spin aşağı üç aliquots (4000 x g, 4 ° C, 10-15 s) ve Aspire edin kapalı kalan arabellek içeriğini ve numune analizine tarafından TEM, geçin Eğer, ya da protein yalıtım. TEM için işleme 0,01 M PBS soğuk % 2.5 oxazolidin 150 µL glomerular granül düzeltin. Sabitleştirici dikkatle Pelet Pelet bozmaya değil emin bir Pasteur pipet kullanarak sonra PBS ile durulanır kaldırmak ve % 1 osmiyum tetroxide içinde % 1 potasyum ferricyanide ile sonrası düzeltebilirim. Etanol kademeli bir dizi örnek kurutmak (30, 50, 70, 90, 100, 100, 0) ve propilen oksit epoksi malzeme gömme embed. Yarı ince kesilmiş (300 nm) bir ultramicrotome ilgili bölümlerde. % 0,5 ile % 1 sodyum borat toluidin Blue leke ve ışık mikroskobunda inceleyebilirsiniz. Ultrathin bölümleri kesme (65 nm), uranyl asetat ve Reynolds kurşun sitrat ile leke ve transmisyon elektron mikroskobunun inceleyin. Eğer işleme PBS çözümde 150 µL % 12 jelatin ekleyin ve hemen bir Pelet oluşturmak için kuru buza koyun. Pelet % 2 paraformaldehyde/1 500 µL içinde emmek PBS gecede 4 ° C’de bir microcentrifuge tüp x Pelet temel bir kalıp içine yerleştirin ve en uygun kesme sıcaklık (OCT) orta Kuru buz üzerine ekleyerek embed. 5-10 µm bölümler bir cryotome üzerinde kesme ve ayirt/immünhistokimya veya standart histolojik lekeleri ile devam edin. Protein yalıtım için 1,5 µL proteaz inhibitörü ile centrifuged glomerular Pelet ve dounce doku homogenizers ile 150 µL RIPA arabelleği ekleyin. Protein miktar ve immunoblotting ya da diğer protein analizi için devam edin.