Caracterização funcional de Carboxylesterases em casa resistente a inseticida moscas, Musca Domestica

Resistência de inseticida é atualmente um grande problema de casa fly controle mundial^1,2. Os esforços para determinar o mecanismo de resistência de inseticida facilita o melhor entendimento desta questão e, assim, fornecer novas estratégias para efetivamente prevenir ou minimizar a propagação de resistência desenvolvimento³. Carboxylesterases, como uma das enzimas de desintoxicação principais, têm atraído muita atenção por seus papéis em sequestro e metabolizar inseticidas em vários insetos^4,5,6. Nosso estudo anterior identificou vários carboxylesterases em moscas domésticas e seus níveis de expressão não foram apenas constitutivamente acima-está regulada na cepa resistente do ALHF, mas também podem ser induzido para maiores níveis em resposta aos tratamentos de permetrina⁷ . No entanto, as caracterizações funcionais destes genes carboxylesterase em metabolizar inseticidas continuam a ser explorado.

Desde o primeiro relatório no início da década de 1980⁸, um sistema de expressão de gene estrangeira mediada por baculovirus tem sido amplamente empregado devido a sua eficiência de produção de alta proteína e proteína eukaryotic processamento recursos⁹. Este sistema binário é composto de dois elementos essenciais: o baculovirus recombinante construído entregando estrangeiros genes em células hospedeiras e a expressão em larga escala de proteínas interessadas por células infectadas por baculovirus recombinante. Nas últimas décadas, o sistema de expressão baculovirus mediada por células tem sido amplamente utilizado para produzir milhares de proteínas recombinantes, variando de enzimas citosólica a proteínas de membrana-limite no inseto e¹⁰células de mamífero. Nosso estudo anterior com êxito manifestou várias enzimas CYP450 em células de inseto Sf9 com este sistema de¹¹. Neste estudo, temos construído um baculovirus recombinante-carboxylesterase para infectar células de inseto Sf9, explorou a tolerância de célula à permetrina diferentes tratamentos e em grande escala expressa carboxylesterase proteínas em vitro para funcional exploração. Em vez de investigar várias misturas de Isozima carboxylesterase de insetos homogenates adoptado pela anteriores estudos^12,13, este sistema de expressão de células de inseto mediada por baculovirus permite a expressão específica e isolamento de proteínas específicas para melhor caracterização das suas propriedades bioquímicas e estruturais.

O ensaio baseado em sal de tetrazólio (MTT) é um método colorimétrico de alta produtividade, desenvolvido e otimizado para medir a viabilidade celular. Este ensaio baseia-se o mecanismo que apenas as células vivas são capazes de metabolizar o reagente MTT amarela a um precipitado de formazan cor roxo escuro, que pode ser analisado colorimetricamente depois dissolvido em solventes orgânicos^{14, 15}. Mais precisos, mas demorados métodos, tais como a exclusão de Trypan azul e a timidina titulação ensaio^16,17, vários foram desenvolvidos nos últimos anos. No entanto, o ensaio de MTT baseada em célula ainda atualmente é reconhecido como o método mais rápido e facilmente operado para detectar rapidamente a viabilidade celular. Aqui, usamos o ensaio de MTT para explorar a tolerância celular contra tratamentos insecticidas. A tolerância melhorada de células quando infectadas com baculovirus recombinante carboxylesterase fortemente suporta as funções metabólicas de carboxylesterases aos inseticidas, que por sua vez, sugere sua participação na resistência de inseticida.

Além disso, um ensaio metabólico em vitro foi também realizado neste estudo. Em comparação com ensaios de carboxylesterase geral que usam substratos comuns tais como acetato de α-napthyl (α-at) e β-naftil acetato (β-NA) para refletir a actividades hidrolíticas de carboxylesterases, o estudo metabólico em vitro é considerado como uma maneira exata para medir diretamente as atividades de carboxylesterases em direção a inseticidas¹⁸. Este método tem sido empregado com sucesso em vários tipos de insetos para caracterizar vários citocromo P450s em associação com inseticida resistência^11,19,20. No entanto, este método ainda não foi aplicado em estudos carboxylesterase. Com a disponibilidade de carboxylesterase proteínas produzidas pelo sistema de expressão mediada por baculovirus, podemos realizar um em vitro estudo metabólico de carboxylesterases em direção a permetrina, que mais pode fornecer fortes evidências do envolvimento de carboxylesterases em conferir resistência piretroide em casa voa.