Выявление и изоляция Oligopotent и Lineage, совершенные миелоидного предшественники костного мозга мыши

Моноциты, нейтрофилов и дендритных клеток (DCs) являются миелоидных клеток, возникающих от гемопоэтических прародителями, главным образом в костном мозге, этот процесс называется myelopoiesis. Общие миелоидного прародителями (CMPs) имеют потенциал для производства миелоидных клеток, а также megakaryocytes и эритроцитов, но не лимфоидных клеток. Предшественники гранулоцитов и моноцитов (ГИП), которые являются производными от CMPs, производят гранулоцитов и моноцитов, но потеряли мегакариоцитов и эритроцитов потенциал. Моноциты и классические и плазмоцитарная DCs (cDCs/PDC) также считается вытекают из общих прародителей, известный как предшественники Моноцит DC (MDPs), которые производятся CMPs. постепенное ограничение потенциал линии в конечном итоге приводит родословную, совершенные прародители: предшественники гранулоцитов, моноцитов прародителями и Предшественники дендритных клеток (рис. 1).

Вайсман и коллеги сообщили, что CMPs находятся в Линь^– c комплект⁺ Sca-1^– (ЛКС^–) CD34 FcγR^Ло часть костного мозга мыши, в то время как ГИП содержатся в CD34 ЛКС^{– + +} FcγR ^Привет часть¹. Однако эти «КПВ» и «GMP» фракции являются весьма разнородными. Например «GMP» фракции также содержит восходящей линии, совершенные гранулоцитов и моноцитов прародителями^1,2. MDPs отдельно сообщается CX3CR1⁺ Flt3⁺ CD115⁺ прародителей, которые также выразить CD34 и FcγR^3,4. MDPs привести к cDC/pDC производство общих DC прародителями (CDP), сообщившие выразить более низкие уровни c-Kit (CD117) и не включаются в ЛКС^– часть⁵.

Ранее предполагалось, что моноциты возникают по одной дорожке (CMP-GMP-MDP-Моноцит). В соответствии с этой модели, совершенные Моноцит прародителями, производимые ГИП (названный Моноцит прародителями, м/с)² и MDPs (названный общих Моноцит прародителями, cMoPs)⁶ , по-видимому, те же клетки на основе общей поверхности маркер выражения . Однако мы недавно продемонстрировали, что моноциты производятся независимо ГИП и MDPs и были в состоянии провести различие между депутаты и cMoPs сингл клеточной РНК последовательности⁷.

Мы недавно изменен Вайсман «КПВ» и «GMP» стробирования стратегии для выявления 6 подфракций костного C57BL/6J мыши, содержащих различные oligopotent и совершенные линии миелоидного progenitor подмножеств. Мы впервые сообщили, что окрашивание для Ly6C и CD115 позволяет изоляции oligopotent ГИП, так как предшественники гранулоцитов (GPs) и Моноцит прародителями (MPs и cMoPs, который мы в настоящее время не в состоянии отделить) от «GMP» часть² (ЛКС ^– CD34⁺ FcγR^Привет ворота; Рисунок 1). Впоследствии мы показали, что MDPs преимущественно находятся в «КПВ» фракции (CD34 ЛКС^{– +} FcγR^Ло ворота), который также содержит Flt3⁺ CD115^Ло и Flt3^– подмножеств⁷ (Рисунок 1 ). CMP-Flt3⁺ CD115^Ло фракция дает ГИП и MDPs после приемных передачи. CMP-Flt3^– подмножество содержит прародителей, которые представляются промежуточные между CMP-Flt3⁺ CD115^Ло клетки и ГИП. В отличие от MDPs CMP-Flt3⁺ CD115^Ло и CMP-Flt3^– фракции также обладают мегакариоцитов и эритроцитов потенциал.

Важно отметить, однако, что это в настоящее время неясно ли «КПВ» фракции содержат прародителей, которые действительно oligopotent (например, отдельных ячеек в CMP-Flt3⁺ CD115^Ло фракции обладают нейтрофилов, Моноцит, DC, мегакариоцитов и потенциальных эритроцитов), или альтернативно, составляют смесь прародителями с более ограниченным потенциалом линии. Колонии, формируя assays (метилцеллюлоза культуры) показали клетки с гранулоцитарный (нейтрофилов), эритроцитов, моноцитов и мегакариоцитов потенциальных (ГЭММ клетки) в «СС», CMP-Flt3⁺ CD115^Ло и фракции CMP-Flt3^{– 1 ,7}, но не позволяют оценку потенциала постоянного тока. В отличие от колонии, формируя assays продемонстрировал существование oligopotent ГИП (предшественники нейтрофилов и моноцитов потенциальных) в «GMP» часть^1,2, и это подтверждается недавно одноклеточного транскриптомики анализ⁸. Это не известно в настоящее время, однако, является ли эти oligopotent ГИП также производить другие гранулоцитов (эозинофилов, базофилов и тучных клеток).

На основании этих исследований, мы теперь продемонстрировать как 7 поверхности маркеры (c комплект Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C и CD115), может использоваться для идентифицировать и изолировать эти 6 подмножества oligopotent и совершенные линии миелоидного прародителями. Протокол, описанные здесь может применяться для анализов в vitro культуры (метилцеллюлоза или жидкости культуры), в естественных условиях приемных передачи эксперименты в мышей и молекулярный анализ (насыпных и одноклеточного последовательности РНК, Западный blotting, и т.д.).

Протокол состоит из 3 этапов: 1) подготовка подвески одной клетки костного мозга клетки, 2) обогащения гемопоэтических прародителями (сортировки) магнитные активации клеток и 3) выявления и изоляции, при желании, прародитель подмножеств потоком цитометрии (с использованием анализатора или сортировщик, в соответствующих случаях). Первым шагом является изоляция клетки костного мозга от бедра и tibias Усыпленных мышей и похож на другие ранее описанные протоколы⁹. Затем образец обогащен для стволовых и прогениторных клеток с помощью коктейль антител против клеток поверхностных маркеров эритроцитов, нейтрофилы, моноциты, лимфоциты и т.д., чтобы истощить дифференцированных клеток. Это не является обязательным, но настоятельно рекомендуется оптимизировать обнаружения подмножеств прародителю и уменьшить количество антител, необходимых для идентификации прародителем и время, необходимое для проточной цитометрии. Родословная истощения протокол ниже описывает Magnetic-Activated ячейку Сортировка (ПДК) с помощью мыши Lineage ячейки истощение Kit (который содержит биотинилированным антитела CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 и тер-119, плюс анти биотин микрошарики) и автоматизированных магнитный сепаратор. Последним шагом является идентификация (и сортировки, если это необходимо) Прародитель подмножеств подачей cytometry. Группа антител, описанных ниже (см. также таблицу 1) была разработана для использования в проточный цитометр (анализатор или Сортировщике) с 4 лазеры (405 нм, 488 нм, 561 Нм, 640 Нм).

Рисунок 1: нейтрофилов, моноцитов и DC прародителями и дифференциация путей. Недавно пересмотренная модель myelopoiesis⁷ иллюстрирован, Вайсман ворота для «CMPs» (синий) и «ГИП» (зеленый)¹ обложил. Эта цифра была изменена Яньес et al. 2017⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.