Identificazione e isolamento di Oligopotent e dei progenitori mieloidi Lineage-commesso dal midollo osseo del topo

Monociti, neutrofili e cellule dendritiche (DCs) sono cellule mieloidi che derivano da progenitori ematopoietici, principalmente nel midollo osseo, tramite un processo chiamato mielopoiesi. Comune dei progenitori mieloidi (CMPs) hanno il potenziale per produrre cellule mieloidi, come pure i megacariociti ed eritrociti, ma cellule non linfoidi. Progenitori del granulocyte-monocito (GMP), che sono derivati da CMPs, producono di granulociti e monociti, ma hanno perso dei megacariociti e potenziali dell’eritrocito. Monociti e classica e plasmacytoid DCs (cDCs/PDC) sono anche pensato di derivano da progenitori comuni, noti come progenitori del monocito-DC (MDPs), che sono prodotte da CMPs. graduale limitazione del potenziale di lignaggio infine provoca lignaggio-commesso progenitori: progenitori granulociti, monociti progenitori e dei progenitori delle cellule dendritiche (Figura 1).

Weissman e colleghi ha riferito che CMPs si trovano in Lin^– c-Kit⁺ Sca-1^– CD34 (LKS^–)⁺ FcγR^lo frazione del midollo osseo di topo, mentre le GMP sono contenute nel CD34 LKS^{– +} FcγR ^Ciao frazione¹. Tuttavia, queste frazioni “CMP” e “GMP” sono molto eterogenee. Per esempio, la frazione “GMP” contiene anche dei progenitori del granulocyte lignaggio-commessi e monocito progenitori^1,2. MDPs separatamente sono stati segnalati per essere CX3CR1⁺ Flt3⁺ CD115⁺ progenitori che inoltre esprimono CD34 e FcγR^3,4. MDPs danno luogo a cDC/pDC-produzione comune DC progenitori (CDP), che sono stati segnalati per esprimere più bassi livelli di c-Kit (CD117) e non sono inclusi nella frazione LKS^{– 5}.

Si è precedentemente ipotizzato che monociti derivano attraverso una singola via (CMP-GMP-MDP-monocito). Coerente con questo modello, monocito-commesso dei progenitori prodotto da PGM (denominato progenitori del monocito, MPs)² e MDPs (denominato comuni progenitori del monocito, cMoPs)⁶ sembrano essere le stesse celle sulla base dell’espressione dei marker di superficie condivisa . Tuttavia, abbiamo recentemente dimostrato che monociti sono prodotte in modo indipendente da GMPs e MDPs e sono stati in grado di distinguere tra MPs e cMoPs di cella singola sequenziamento del RNA,⁷.

Abbiamo recentemente modificato il Weissman “CMP” e “GMP” gating strategia per identificare 6 subfractions del midollo osseo di topo C57BL/6J contenente diversi oligopotent e sottoinsiemi di lignaggio-commesso progenitrici mieloidi. Abbiamo segnalato prima che la macchiatura per Ly6C e CD115 consente l’isolamento di GMPs oligopotent, così come di progenitori del granulocyte (GPs) e di progenitori del monocito (MPs e cMoPs, che siamo attualmente in grado di separare) dalla frazione “GMP”² (LKS ^– CD34⁺ FcγR^Ciao cancello; Figura 1). Abbiamo successivamente dimostrato che MDPs si trovano principalmente nella frazione “CMP” (CD34 LKS^{– +} FcγR^lo cancello), che contiene anche Flt3⁺ CD115^lo e Flt3^– sottoinsiemi⁷ (Figura 1 ). Il CMP-Flt3⁺ CD115^lo frazione rendimenti sia GMPs e MDPs su trasferimento adottivo. Il sottoinsieme di CMP-Flt3^– contiene dei progenitori che sembrano essere intermedi tra^lo cellule CD115 CMP-Flt3⁺ e GMP. A differenza di MDPs, CMP-Flt3⁺ CD115^lo sia il CMP-Flt3^– frazioni anche possiedono megacariocita e potenziali dell’eritrocito.

È importante notare, tuttavia, che non è attualmente chiaro se le frazioni “CMP” contengono progenitori che sono veramente oligopotent (ad es., cellule individuali all’interno del CMP-Flt3⁺ CD115^lo frazione che possiedono dei neutrofili, monociti, DC, megacariocita e potenziali dell’eritrocito), o in alternativa, comprendono una miscela di progenitori con più limitato potenziale di lignaggio. Colonie del saggi (culture metilcellulosa) ha rivelato le cellule con potenziale megacariocita (cellule di GEMM) in “CMP”, dell’eritrocito, monociti e granulociti (neutrofili) CMP-Flt3⁺ CD115^lo e frazioni di CMP-Flt3^{– 1 ,7}, ma non consentono la valutazione del potenziale di DC. Al contrario, Colonia formando le analisi ha dimostrato l’esistenza di oligopotent PGM (progenitori con neutrofili e monociti potenziali) in “GMP” frazione^1,2, e questo è supportato da recenti unicellulare di analisi trascrittomica⁸. Non è attualmente noto, tuttavia, se questi PGM oligopotent produrre anche altri granulociti (eosinofili, basofili e mastociti).

Sulla base di questi studi, ora dimostriamo come 7 marcatori (c-Kit, Sca-1, CD34, FcγR, Flt3, Ly6C e CD115) di superficie può essere utilizzato per identificare e isolare questi 6 sottogruppi della oligopotent e dei progenitori mieloidi lignaggio-commesso. Il protocollo descritto qui può essere applicato per i test di cultura in vitro (colture di metilcellulosa o liquido), esperimenti di trasferimento adottivo in vivo in topi e l’analisi molecolare (sequenziamento di RNA alla rinfusa e a cella singola, Western blotting, ecc).

Il protocollo consiste di 3 fasi: 1) preparazione di una sospensione di singola cellula del midollo osseo cellule, 2) arricchimento di progenitori ematopoietici (ordinamento magnetico-attivata delle cellule) e 3) l’identificazione e l’isolamento se lo si desidera, dei sottoinsiemi di cellule progenitrici di flusso cytometry (utilizzando un analizzatore o un fascicolatore, come appropriato). Il primo passo è l’isolamento delle cellule del midollo osseo dai femori e le tibie di topi eutanasizzati ed è simile ad altri protocolli precedentemente descritti⁹. Successivamente, il campione si arricchisce per cellule staminali e progenitrici usando un cocktail di anticorpi contro gli indicatori di superficie delle cellule di eritrociti, i neutrofili, monociti, linfociti, ecc., per vuotare le cellule differenziate. Questo non è obbligatorio, ma fortemente consigliato per ottimizzare il rilevamento dei sottoinsiemi progenitore e per ridurre la quantità di anticorpi necessari per l’identificazione di cellule progenitrici e il tempo necessario per citometria a flusso. Il protocollo di deplezione di lignaggio qui sotto descrive l’ordinamento delle cellule Magnetic-Activated (MACS) utilizzando un Kit di svuotamento di Mouse Lineage delle cellule (che contiene anticorpi biotinilati CD5, CD45R (B220), CD11b, Gr-1 (Ly6G/C), 7-4 e Ter-119, plus anti-biotina microsfere) e un separatore magnetico automatizzato. Il passo finale è l’individuazione (e l’ordinamento, se lo si desidera) dei sottoinsiemi progenitore tramite flusso cytometry. Il pannello di anticorpi descritti di seguito (Vedi anche tabella 1) è stato progettato per essere utilizzato in un citometro a flusso (analizzatore o selezionatore) con 4 laser (405 nm, 488 nm, 561 nm, 640 nm).

Figura 1: vie di differenziazione e progenitori dei neutrofili, monociti e DC. Il modello recentemente riveduto della mielopoiesi⁷ è illustrato, con i cancelli di Weissman per “CMP” (blu) e “PGM” (verde)¹ sovrapposti. Questa figura è stata modificata da Yáñez et al 2017⁷. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.