Özet

L’Identification des phéromones de la lamproie marine à l’aide de fractionnement Bioassay-guidé

Published: July 17, 2018
doi:

Özet

Nous présentons ici un protocole visant à isoler et de caractériser la structure, puissance olfactive et réaction de composés de phéromones putatifs de la lamproie marine.

Abstract

Fractionnement guidée par essai biologique est une approche itérative qui utilise les résultats des essais biologiques physiologiques et comportementales pour guider l’isolement et l’identification d’un composé actif de phéromone. Cette méthode a entraîné la caractérisation réussie des signaux chimiques qui fonctionnent comme des phéromones dans un large éventail d’espèces animales. La lamproie marine se fient olfaction pour détecter les phéromones qui médient réponses comportementales et physiologiques. Nous utilisons cette connaissance de la biologie des poissons à proposer des fonctions de phéromones putatifs et pour guider l’isolement et l’identification des composantes de l’actif de phéromone. La chromatographie est utilisée pour extraire, se concentrer et de séparer les composés de l’eau conditionnée. Électro-olfactogramme (EOG) enregistrements sont effectuées pour déterminer quelles fractions provoquer des réponses olfactifs. Tests comportementaux labyrinthe deux choix sont ensuite utilisés pour déterminer si une des fractions odorantes sont également actif sur le plan comportemental et induire une préférence. Méthodes spectrométriques et spectroscopiques fournissent le poids moléculaire et l’information structurale pour aider à l’élucidation de la structure. L’activité biologique des composés purs se confirme avec EOG et tests comportements. Les réponses comportementales observées dans le labyrinthe en fin de compte doivent être validés qu’en milieu de terrain pour confirmer leur fonction dans un cadre de cours d’eau naturel. Ces essais biologiques jouent un rôle double pour 1) guider le processus de fractionnement et 2) confirmer et préciser la bioactivité des composants isolés. Ici, nous rapportons les résultats représentatifs d’une identification de phéromone de la lamproie marine qui illustrent l’utilité de l’approche guidée par bioessai fractionnement. L’identification des phéromones de la lamproie marine est particulièrement importante parce qu’une modulation de son système de communication de phéromone est parmi les options envisagées pour contrôler la lamproie de mer envahissante dans les Grands Lacs laurentiens. Cette méthode peut être facilement adaptée pour caractériser la communication chimique dans un large éventail de taxons et de faire la lumière sur l’écologie chimique d’origine hydrique.

Introduction

Les phéromones sont des signaux chimiques spécifiques, libérés par les personnes qui les aident à localiser les sources de nourriture, détecter les prédateurs et médiation des interactions sociales de leurs congénères1. Communication de la phéromone chez les insectes a été bien étudiée2; Cependant, l’identification chimique et la fonction biologique des phéromones de vertébrés aquatiques n’ont pas été étudiées aussi largement. Connaissance de l’identité et la fonction des phéromones libéré peuvent être appliquées pour faciliter la récupération des espèces menacées,3,4 ou contrôle antiparasitaire espèces5,6. L’application de ces techniques nécessite l’isolement et la caractérisation des composants bioactifs de phéromone.

Identification de la phéromone est une branche de la chimie des produits naturels. Progrès dans la recherche de phéromone a été partiellement limité en raison de la nature des molécules phéromones eux-mêmes. Les phéromones sont souvent instables et publié en petites quantités, et seulement quelques techniques d’échantillonnage existent pour détecter des quantités infimes de volatiles7,8 ou des composés solubles dans l’eau9. Méthodes pour identifier les phéromones comprennent 1) un dépistage ciblé des composés connus, métabolomique) 2 et 3) guidée par bioessai fractionnement. Un dépistage ciblé des composés connus les tests disponibles dans le commerce des sous-produits métaboliques des processus physiologiques hypothétiquement fonctionnent comme des phéromones. Cette approche est limité parce que les chercheurs peuvent tester uniquement composés connus et disponibles. Toutefois, il a conduit à l’identification réussie des hormones sexuelles chez le poisson rouge qui fonctionnent comme phéromones10,11,12. La métabolomique est une deuxième approche d’identification de phéromone qui distingue les produits métaboliques potentiels de petites molécules dans un système biologique13. Une comparaison des profils métaboliques des deux groupes (c.-à-d., un actif contre un extrait inactif) permet l’identification d’un profil métabolique potentiel de qui le métabolite est épuré, la structure est élucidée et les bioactivité est confirmé14. Effets additifs ou synergiques des formulations complexes des mélanges spécifiques sont plus susceptibles d’être détectés avec la métabolomique, parce que les métabolites sont considérés ensemble plutôt que comme une série de fractions13. Pourtant, la mise en œuvre de la métabolomique repose sur la disponibilité des références synthétiques parce que les données qui en résulte ne facilitent pas l’élucidation des nouvelles structures.

Fractionnement guidée par essai biologique est une approche intégrée et itérative qui s’étend sur deux domaines : chimie et biologie. Cette approche utilise les résultats des essais biologiques physiologiques et comportementales pour guider l’isolement et l’identification d’un composé actif de phéromone. Un extrait brut est fractionné par une propriété chimique(p. ex., taille moléculaire, polarité, etc.) et testé avec enregistrements électro-olfactogramme (EOG) et/ou dans un test biologique. Les composants bioactifs sont éliminés en répétant ces étapes de fractionnement et EOGs et/ou biologiques. Les structures des composés actifs purs ont été dégagés par les méthodes spectrométriques et spectroscopiques, qui assurent le poids moléculaire et l’information structurale pour produire un modèle de ce composé à être synthétisé. Guidée par bioessai fractionnement peut produire divers métabolites et potentiellement roman phéromones avec des squelettes chimiques uniques qui ne risquent pas d’être prédites par les voies de biosynthèse.

Nous décrivons ici le protocole de fractionnement guidée par essai biologique utilisé pour isoler et de caractériser la bioactivité de la lamproie de mer mâle sex pheromone composés. La lamproie marine (Petromyzon marinus) est un modèle idéal de vertébrés pour étudier la communication phéromonale parce que ces poissons s’appuient fortement sur la détection olfactive des signaux chimiques d’arbitrer leur histoire de vie anadrome composé de trois étapes distinctes : les larves, juvénile et adulte. Larve de la lamproie marine se terrent dans les sédiments des cours d’eau douce, subissent une métamorphose radicale et de transforme en juvéniles qui migrent d’un lac ou l’océan où ils parasitent les poissons de la grande hostie. Après avoir détaché du poisson hôte, les adultes migrent vers des ruisseaux frayères, guidé par les phéromones migrateurs publiés par flux résident larves15,16,17,18,19 . Les mâles matures montent sur les frayères, libérer une phéromone de sexe multi-composants pour attirer des compagnons, frayer par intermittence pendant environ une semaine et puis mourir15,20. L’identification des phéromones de la lamproie marine est importante parce qu’une modulation du système de communication phéromone est parmi les options envisagées pour contrôler les lamproies marines envahissantes dans les Grands Lacs laurentiens21.

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité de Michigan State University (AUF # 03/14-054-00 et 02/17-031-00). 1. collecte et Extraction de la lamproie marine conditionné eau Place maturité sexuelle masculine la lamproie marine (15-30 animaux) dans un réservoir fourni avec 250 L d’eau gazeuse de lac Huron maintenue à 16-18 ° C. Recueillez l’eau conditionné par l’homme tout au long de chaque nuit…

Representative Results

Un schéma résumant les étapes décrites dans le protocole du fractionnement guidée par essai biologique est donné à la Figure 1. Le protocole, procédez comme pour les isoler et de caractériser la structure, la puissance olfactive et l’activité comportementale des 5 phéromones putatifs de la lamproie (Figure 2). À l’aide de la spectrométrie de masse et les données de la RMN (Figure 3 …

Discussion

Poissons vivants dans un monde chimique de composés encore être identifiés. Guidée par bioessai fractionnement s’est avérée essentiel pour identifier et caractériser les molécules bioactives qui assurent la médiation de nombreuses interactions chimiques, tels que ceux observés en saumon masu31, éléphants d’Asie,32et la grande lamproie marine33, 34,35. Fractionnemen…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions l’US Geological Survey Hammond Bay Station biologique pour l’utilisation de leurs installations de recherche et le personnel du U.S. Fish and Wildlife Service et Pêches et Océans Canada pour fournir de la lamproie marine. Cette recherche a été financée par des subventions de la Commission des pêcheries des grands lacs à Weiming Li et Ke Li.

Materials

Premium standard wall borosilicate capillaries with filament  Warner Instruments G150F-4 recording and reference electrode (OD 1.5 mm, ID 0.86 mm)
Pipette puller instrument  Narishige PC-10 pulls electrodes for EOGs
Diamond-tipped glass cutter Generic cut tip of electrodes for EOG
Borosilicate glass capillaries World Precision Instruments 1B150-4 odorant delivery tube for EOG
Recording electrode holder E Series straight body with Ag/AgCl pellet for glass capillary OD 1.5 mm Warner Instruments ESP-M15N recording electrode holder
Reference electrode holder E Series with handle with  Ag/AgCl pellet  for glass capillary OD 1.5 mm Warner Instruments E45P-F15NH reference electrode holder
1 mm pin Warner Instruments WC1-10 to bridge reference and recording electrode holders
2 mm pin Warner Instruments WC2-5 to bridge reference and recording electrode holders
Agar Sigma A1296 molten agar to fill electrodes
Potassium chloride (KCl) Sigma P9333 3M KCl to fill electrodes and electrode holders
Micropipette microfil World Precision Instruments MF28G-5 to fill electrodes and electrode holders 
L-Arginine Sigma A5006 positive control odorant for EOG
Methanol Sigma 34860
Water bath Custom made N/A holds odorants for EOG
3-aminobenzoic acid ethyl ester (MS222) Syndel USA Tricaine1G EOG anesthetic 
Gallamine triethiodide Sigma G8134-5G EOG paralytic
1 mL syringe BD Biosciences 301025 to administer paralytic
Subcutaneous needle 26G 5/8 BD Biosciences 305115 to administer paralytic
Roller clamp World Precision Instruments 14043-20 adjust flow rate of anesthic into lamprey's mouth
Sodium chloride (NaCl) J.T. Baker 3624-05 for preparation of 0.9% saline
V-shaped plastic stand as specimen stage Custom made N/A holds lamprey during EOG
Plastic trough Custom made N/A holds V-shaped plastic stand during EOG
Scalpel Blades – #11 Fine Science Tools 10011-00 for EOG dissection
Scalpel Handle – #3 Fine Science Tools 10003-12 for EOG dissection
Straight ultra fine forceps Fine Science Tools 11252-00 for EOG dissection, Dumont #5SF Forceps
Curved ultra fine forceps Fine Science Tools 11370-42 for EOG dissection, Moria MC40B
Straight pring Scissors Fine Science Tools 15003-08 for EOG dissection
Stereomicroscope Zeiss Discovery V8 for EOG dissection
Illuminator light Zeiss CL 1500 ECO for EOG dissection
Plastic tubing Generic to connect re-circulating EOG setup and water baths
Odorant delivery tubing  Custom made N/A
In line filter and gasket set Lee Company TCFA1201035A
Micromanipulators Narishige MM-3 to position electrodes and odorant delivery capillary tube
Magnetic holding devices Kanetec MB-K
Valve driver Arduino custom made to control the opening of the valve for odor stimulation
Electromagnetic valve Lee Company LFAA1201618H valve for odor stimulation
NeuroLog AC/DC amplifier Digitimer Ltd. NL106 to increase the amplitude of the elictrical signal
NeuroLog DC pre-amplifier with headstage Digitimer Ltd. NL102G to increase the amplitude of the elictrical signal
Low-pass 60 Hz filter Digitimer Ltd. NL125
Digitizer Molecular Devices LLC Axon Digidata 1440A
Dell computer (OptiPlex 745) running Axoscope data acquistion software Molecular Devices LLC AxoScope version 10.4 
Faraday cage Custom made N/A Electromagnetic noise shielding
Two-choice maze Custom made N/A waterproofed marine grade plywood covered with plastic liner
Trash pump Honda WT30XK4A fills maze with water from nearby river
Peristaltic pump with tubing Cole Parmer Masterflex 07557-00 to adminster odorants in maze
Inverter Generator  Honda EU1000i powers perstaltic pump
Release cage Custom made N/A used to acclimate lamprey in the maze
Mesh Generic used to contain the dimensions of the maze and minimize water turbulance with mesh rollers
Buckets (5 gallon) Generic to mix odorants
Flow meter Marsh-McBirney Flo-Mate 2000 to measure discharge
XAD 7 HP resin Dow chemical 37380-43-1 for extraction of conditioned water 
Methanol Sigma 34860 for extraction of conditioned water 
Water bath Yamato BM 200 for extraction of conditioned water 
Freeze dryer Labconco CentriVap  Concentrator for extraction of conditioned water 
chloroform Sigma CX1050 for isolation of fraction pools
Silica gel 70-230 mesh Sigma 112926-00-8 for isolation of fraction pools
Silica gel 230-400 mesh Sigma 112926-00-8 for isolation of fraction pools
Pre-coated silica gel TLC plates Sigma 99571 for isolation of fraction pools
anisaldehyde Sigma A88107 for isolation of fraction pools
Sephadex LH-20 GE Healthcare 17-0090-01 for isolation of fraction pools
Amberlite XAD 7 HP resin Sigma XAD7HP for extraction of conditioned water 
4, 2.5L capacity glass columns Ace Glass Inc. 5820 for extraction of conditioned water 
Acetone Sigma 650501 for extraction of conditioned water 
TQ-S TOF LC Mass spectrometer (or equivalent) Waters Co. N/A for structure elucidation
Binary HPLC pump Waters Co. 1525 for isolation of fraction pools/compounds
Agilent NMR spectrometer, 900MHz (or equivalent) Agilent N/A for structure elucidation
Rotovap drying system Buchi RII for extraction of conditioned water 
UV lamp (254 nm) Spectronics Co. ENF-240C for thin layer chromatography 

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