Aufrechterhaltung der biologischen Kulturen und Messung der Genexpression in Aphis Nerii: Non-Modellsystem für Pflanzen-Insekten-Interaktionen
Özet
Die Blattlaus Aphis Nerii kolonisiert auf stark verteidigte Pflanzen in der Familie Definitionen (Apocyanaceae) und bietet zahlreiche Möglichkeiten, Pflanzen-Insekten-Interaktionen zu untersuchen. Hier stellen wir eine Reihe von Protokollen für die Wartung von Anlagen und Blattlaus, Kulturen, und die Erzeugung und Analyse von molekularen und Omic – Daten für A. Nerii.
Abstract
Blattläuse sind hervorragende experimentelle Modelle für eine Vielzahl von biologischen Fragestellungen, die die Entwicklung von Symbiosen und die Entwicklung der Polyphenisms bis hin zu Fragen des Insekts Interaktionen mit ihren Wirtspflanzen. Genomische Ressourcen stehen für verschiedene blattlausarten und mit Fortschritten in der Next Generation Sequencing, transkriptomischen Studien sind auf nicht-Modellorganismen, die Genome fehlt ausgedehnt wird. Darüber hinaus können Blattlaus Kulturen gesammelt aus dem Feld und im Labor für den Einsatz in organismal und molekularbiologische Experimente, die Lücke zwischen ökologischen und genetischen Studien aufgezogen. Endlich viele Blattläuse sind im Labor auf ihre bevorzugten Wirtspflanzen im ewigen, Marbled Lebenszyklen ermöglicht Vergleiche asexually reproduzieren Genotypen pflegbar. Aphis Nerii, Wolfsmilch-Oleander-Blattlaus, bietet ein solches Modell um Insekt Interaktionen mit giftigen Pflanzen mit organismal und molekulare Experimente zu untersuchen. Methoden für die Erzeugung und die Wartung der Anlage und Blattlaus Kulturen in das Gewächshaus und Labor, DNA- und RNA-Extraktion, Mikrosatelliten-Analyse, de Novo Transkriptom Montage- und Annotation, Transkriptom differentielle expression Analyse, qPCR Überprüfung der differentiell exprimierten Genen beschrieben und hier diskutiert.
Introduction
Blattläuse sind kleine, hemimetabolous Insekten, die auf unterschiedlichen Pflanzenfamilien weltweit zu kolonisieren. Sie sind charakteristisch für verschiedene Funktionen, insbesondere ihre komplexen Lebenszyklen mit zyklische Parthenogenese und diskrete Polyphenisms und ihre obligatorische ernährungsphysiologischen Symbiosen mit Bakterien oder Hefen Endosymbionts, die Nährstoffversorgung fehlt Ihre Ernährung der Pflanze SAP-1. Während die meisten Blattläuse Host Pflanze Spezialisten, einige allgemeine Arten sind wichtige Pflanzenschädlinge zuzufügen beträchtlichen wirtschaftlichen Schaden auf Pflanzen entweder direkt oder über die Krankheitserreger und Viren sie Vektor-2. Die Veröffentlichung des ersten Blattlaus-Genoms im Jahr 2010 die Erbse Blattlaus Acyrthosiphon Pisum3, markiert einen wichtigen Meilenstein in der Erforschung der Biologie der Blattlaus, weil es die genomischen Ressourcen für Adressierung Fragen rund um des Insekts zur Verfügung gestellt Anpassungen an den pflanzenfressenden Lebensstil, einschließlich derer, die zu einer besseren Kontrolle Strategien4führen könnte. Seit dieser Zeit haben zusätzliche genomische Ressourcen mit der Veröffentlichung von einer kommentierten Genom für die Sojabohne Blattlaus Aphis Glycine5und öffentlich verfügbare gesamte Genom Ressourcen für eine weitere drei-Blattlaus-Arten (Myzus angesammelt. Cerasi (schwarze Kirsche Blattlaus), Myzus Persicae (Pfirsich-Kartoffel-Blattlaus), Rhopalosiphum Padi (Vogel-Kirsche-Oat Blattlaus)6. Wertvolle de Novo transkriptomischen Ressourcen stehen zur Verfügung sowie für eine Reihe von anderen blattlausarten (e.g.,Aphis Gossypii (Baumwolle Blattlaus)7, Sitobion Avenae (Korn Blattlaus)8, Cinara Pinitabulaeformis (Kiefer Blattlaus)9, Aphis Nerii (Wolfsmilch-Oleander Blattlaus)10).
Auch unternommen dauerhafte Beiträge zu unserem Verständnis von der Pflanzen-Insekten-Interaktionen und die Ökologie des Lebens die Blattläuse auf Pflanzen11. Ein Bereich wo Blattläuse besonders wichtige Beiträge geleistet haben, ist in unserem Verständnis der chemischen Ökologie von der Gastgeber-Pflanze-Interaktionen. Pflanzenfressenden Insekten zum Ausdruck bringen vielfältige Anpassungen profitieren für Überwindung Pflanze Verteidigung, und einige sogar pflanzlichen Abwehrmechanismen für eigene kooptieren12,13,14. Beispielsweise ist die Wolfsmilch-Oleander-Blattlaus Aphis Nerii, ein helles Gelb, invasive Blattlaus gefunden in gemäßigten und tropischen Regionen der Welt, die Pflanzen in der Familie Wolfsmilch (Lobelia) besiedelt. Pflanzen in der Familie Lobelia entstanden diverse Chemische Abwehr, einschließlich milchige Latex und Herzglykoside bekannt als Cardenolides, die Binden des kation Trägers Na, K-ATPase und wirksame Abschreckung Generalist Pflanzenfresser15, 16. Wolfsmilch Spezialisten express verschiedene Modi des Widerstands gegen die Cardenolides und einige selektiv oder passiv ansammeln oder Cardenolides in ihren Geweben zu ändern, als ein Mittel, um Raub zu verhindern oder für andere Leistungen-17. A. Nerii wird gedacht, um Cardenolides auf diese Weise absondern, obwohl die Mechanismen und funktionale Vorteile unklar10,18 bleiben.
Angesichts der genomischen Mittel zur hand, bietet A. Nerii ein ausgezeichnetes experimentelles Modell für die Untersuchung der molekularen und genetischen Mechanismen die Chemo-ökologische Wechselwirkungen zwischen toxischen Wirtspflanzen und ihrer fachlichen Pflanzenfresser. Es ist erwähnenswert, dass, während einige der frühesten Studien der A. Nerii konzentrierte sich auf Sequestrierung von Cardenolides19, seit dieser Zeit Studien von A. Nerii Einblicke in eine breite Palette von evolutionären und ökologische Fragen zur Verfügung gestellt haben, einschließlich der genetischen Struktur von invasiven Insekten20 und das Zusammenspiel zwischen Bottom-Up- und Top-Down-Verordnung über die Pflanzenfresser Dichte21. A. Nerii ist somit ein guter Kandidat als ein experimentelles Modell für eine besonders breite Palette von Studien über das Insekt-Pflanze-Interaktionen. Kritisch für den Erfolg jeder Studie mit A. Nerii ist die sorgfältige Kultur der Blattlaus Bevölkerungen, die die Kultur der Pflanzen umfasst die Blattläuse abhängen, sowie eine effiziente Erzeugung von qualitativ hochwertigen – Omic Daten. Unser Ziel ist es, den Leser durch beide führen. Nachstehend beschriebenen sind Methoden für die Erzeugung und die Wartung der Anlage und Blattlaus Kulturen im Gewächshaus und Labor, DNA und RNA Extraktionen, Mikrosatelliten-Analyse, de Novo Transkriptom Montage und Annotation, Transkriptom differentielle Expressionsanalyse und qPCR rufsakademie ausgedrückt differentiell Gene. Während diese Methoden für A. Neriigeschrieben werden, können die allgemeinen Methoden der Kultivierung, Extraktion und Analyse verschiedener blattlausarten erweitern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es ist lang erkannt worden, dass die Aposematic A. Nerii Einblicke in die Muster und Mechanismen der Resistenz gegen Pflanze Verteidigung und vor allem chemische Bindung18,37bieten kann. Eine Reihe von genomischer Ressourcen sind vor kurzem entstanden, A. Nerii10, bieten neue Möglichkeiten für ökologische und funktionelle Genomik Studien, die A. Nerii als Modell verwenden. Wir skizzieren die grundlegenden Prot…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten danken Michelle Moon (Vanderbilt University) für Unterstützung mit der Fotografie. Vanderbilt University zur Verfügung gestellt ist, PA und SSLB von DGE-1445197 unterstützt.
Materials
| Sun Gro Fafard Germination Mix | Hummert International | 10-0952-2 | |
| Sun Gro Fafard 3B/ Metro Mix | Hummert International | 10-0951-2 | |
| 2x 4" Round Standard Pot | Anderson Pots | 1503 | |
| DreamTaq DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific | EP0701 | |
| Trizol | ThermoFisher Scientific | 15596026 | |
| SuperScript® III First-Strand Synthesis kit | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4367659 |
Referanslar
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