Rapido, sicuro e semplice manuale sul comodino estrazione dell'acido nucleico per la rilevazione del Virus in campioni di sangue intero

In epidemie di virus, quando i pazienti sono limitati per i reparti di isolamento dell’ospedale o quando è necessaria una diagnosi veloce, sicura, semplice ed accurata diagnosi molecolare point-of-care è di importanza fondamentale per il contenimento di cura e rischio paziente. I due recenti focolai virali, del virus dell’Ebola (EBOV) in Africa occidentale (2013) e il virus di Zika in Sud America (2015), hanno aumentato l’interesse per migliorato point-of-care test diagnostici molecolari, come ad esempio isotermica mediata da loop trascrizione inversa amplificazione (RT-LAMP)^1,2 e ricombinasi polimerasi amplificazione (RPA)^3,4. RPA e RT-lampada sono rapidi, sensibili e specifici test molecolari che possono essere eseguite sui preparativi di esempio semplificato. Per il virus di Zika, RT-LAMP è stato combinato con un’analisi di flusso laterale (LFA), in grado di rilevare virus di Zika in campioni di sangue intero di non purificate entro 30 min¹; Tuttavia, per EBOV, che è classificato come agente patogeno del gruppo 4 di rischio ed è altamente contagiosa, i campioni devono essere gestite sotto biosicurezza 4 (BSL-4) condizioni di livello e inattivati prima di possono eseguire qualsiasi sicuro procedure diagnostiche.

Metodi di inattivazione semplificata per EBOV, come l’aggiunta di buffer di lisi per il campione^2,3,4,5, sono stati usati durante lo scoppio; Tuttavia, questi metodi richiedono una gestione in condizioni di BSL-4 con apparecchiature di laboratorio, quali biosicurezza BSL-3, centrifughe, blocchi di riscaldamento e pipette, come minimo. Questa apparecchiatura normalmente non è presente nei reparti di isolamento o in ospedali da campo. Per superare questa sfida, sono stati tentativi di eseguire la diagnostica in valigie³, e diversi dispositivi portatili e le macchine sono state sviluppate [ad esempio, un dispositivo portatile per estrazione di acidi nucleici (NA)]⁶. Tuttavia, i campioni positivi EBOV devono ancora essere inattivati prima che questi dispositivi possono essere utilizzati.

Precedentemente abbiamo segnalato un metodo di inattivazione rapida virus sul comodino per il EBOV⁷e la Vaccinia virus del Cowpox virus⁸ tramite l’aggiunta di un buffer di lisi/associazione commerciale in provette di raccolta del sangue di vuoto ordinario, consentendo per la diretta trasferimento di sangue dal paziente nel buffer inattivazione⁷. Questa inattivazione diretta e immediata in un sistema chiuso Elimina la necessità di gestire i campioni utilizzando qualsiasi contenimento rigoroso, ad esempio BSL-4 condizioni⁷, e i campioni possono essere gestiti in condizioni normali di BSL-2. Questo metodo di inattivazione è compatibile con diversi sistemi di estrazione di NA, come robot e mano purificazione Kit⁷; Tuttavia, questi metodi richiedono apparecchiature di laboratorio, come robot, centrifughe e l’elettricità, che non sono sempre presenti nel campo impostazioni o all’interno di reparti ospedalieri isolamento.

In questo rapporto, descriviamo un sicuro, rapido e semplificato NA estrazione metodo manuale per la successiva rilevazione molecolare di un virus nel sangue intero inattivato di buffer di lisi/associazione. Il metodo di estrazione NA non richiede attrezzature diverse da un supporto magnetico/magnetico. Nessun centrifughe, riscaldamento isolati, o energia elettrica sono necessari per l’estrazione di NA. Quindi, questo metodo non è dipendente da strutture di laboratorio e può essere facilmente utilizzato ovunque (ad esempio, in ospedali da campo, in reparti ospedalieri di isolamento o con impostazioni di risorse limitate). Il metodo di estrazione del NA è rapida e semplice e può essere utilizzato direttamente in qualsiasi test NA a valle, quali qPCR, RT-qPCR, lampada o RT-LAMP. Quando questo metodo di estrazione del NA è combinato con uno strumento portatile a batteria isotermico e lampada, una comodino diagnosi possono essere ottenuta in 40 min della raccolta sangue.