Özet

Быстрый, безопасный и простой ручной прикроватные нуклеиновой кислоты извлечения для обнаружения вируса в пробах цельной крови

Published: June 30, 2018
doi:

Özet

Здесь мы представляем протокол для извлечения антивирусную нуклеиновой кислоты из цельной крови инактивированный вирус. Добыча осуществляется непосредственно в пробирки и не требует оборудования или электричество. Метод не зависит от лабораторных объектов и могут быть использованы в любом месте (например, в полевых госпиталях).

Abstract

Быстрая диагностика инфекции имеет важное значение для управления вспышки, сдерживание рисков и ухода за пациентами. Ранее мы показали метод для быстрого прикроватные инактивация вируса Эбола во время забора крови для безопасного нуклеиновой кислоты (NA) тестов, добавив коммерческих лизис/привязки буфера непосредственно в вакуумной пробирки. Используя этот подход прикроватные инактивации, мы разработали безопасного, быстрого и упрощенного метода прикроватные NA извлечения для последующего обнаружения вируса в крови целом инактивированная буфера lysis/привязки. NA добыча производится непосредственно в пробирки и не требует оборудования или электричество.

После того, как кровь собирается в буфере lysis/привязки, содержание смешиваются, щелкая трубки вручную, и смесь инкубировали в течение 20 минут при комнатной температуре. Магнитные стекла частиц (MGPs) добавляются к трубе, и содержание смешиваются, щелкая трубки коллекции вручную. MGPs затем собираются на стороне пробирка с помощью магнита и магнитным держателем или резинкой. MGPs промывают три раза, и после добавления Элюирующий буфер непосредственно в коллекции трубку, NAs готовы для испытаний NA, например ПЦР или изотермический цикл амплификации (лампа), без удаления MGPs от реакции. Метод извлечения NA не зависит от каких-либо лабораторных объектов и могут быть легко использованы в любом месте (например, в полевые госпитали и больницы изоляторах). Когда этот метод извлечения NA сочетается с лампой и портативный инструмент, диагноз можно получить в течение 40 мин сбора крови.

Introduction

В ситуациях вспышки вируса когда пациенты сводятся к изоляции стационарах или когда требуется быстрый диагноз, безопасной, простой и точной точки обслуживания молекулярной диагностики является императивом для пациента ухода и риска сдерживания. Два недавних вспышек вирусных, вирус Эбола (EBOV) в Западной Африке (2013) и вирус Зика в Южной Америке (2015), повысили интерес к улучшение обслуживания точки молекулярных диагностических тестов, например обратная транскрипция цикла опосредованной изотермический амплификация (RT-лампа)1,2 и рекомбиназа полимеразы амплификации (РПА)3,4. RT-лампа и РПА, быстрое, чувствительной и конкретные молекулярные тесты, которые могут быть выполнены на упрощенный пример подготовки. Для вируса Зика RT-лампа была объединена с бокового потока проба (LFA), который может обнаружить вирус Зика проб неочищенных цельной крови в течение 30 мин-1; Однако, для EBOV, который классифицируется как риск группы 4 возбудителя и очень заразна, образцы необходимо обрабатывать по биобезопасности уровня 4 (BSL-4) условия и инактивированных перед любой безопасной диагностические процедуры могут быть выполнены.

Упрощенные инактивации методы для EBOV, такие как добавление лизис буферов для образца2,3,4,5, были использованы во время вспышки; Однако эти методы требуют обработки условиях BSL-4 с лабораторным оборудованием, например биобезопасности шкафы BSL-3, центрифуги, Отопление блоков и пипетки, как минимум. Это оборудование обычно не присутствует, в следственных изоляторах или в полевых госпиталях. Чтобы преодолеть эту проблему, были предприняты попытки для выполнения диагностики в чемоданах3, и несколько портативных устройств и машин были развитые [например, портативное устройство для извлечения нуклеиновой кислоты (NA)]6. Однако EBOV-позитивных образцов необходимо инактивированная, прежде чем эти устройства могут быть использованы.

Мы уже ранее сообщали метод инактивации антивирусную Тумба для EBOV7, Vaccinia вируса и вирус коровьей8 добавлением буфера коммерческих лизис/привязки для обычных вакуумной пробирки, позволяя для прямого Передача крови от пациента в инактивации буфера7. Это прямой и непосредственный инактивации в закрытой системе устраняет необходимость для обработки образцов с помощью любой строгий сдерживания, например BSL-4 условия7, и образцы могут быть обработаны при нормальных условиях BSL-2. Этот метод инактивации совместим с несколькими системами извлечения NA, таких как роботы и ручной очистки наборы7; Однако эти методы требуют лабораторного оборудования, таких как роботы, центрифуги и электричество, которые не всегда присутствуют в поле Параметры или внутри изоляции стационарах.

В настоящем докладе мы описываем безопасного, быстрого и упрощенного метода ручной NA извлечения для последующего молекулярной обнаружения вируса в крови целом инактивированная буфера lysis/привязки. Метод извлечения NA не требуют никакого оборудования помимо магнит/магнитный держатель. Нет центрифуги, Отопление блоков, или электричество необходимо для извлечения NA. Следовательно, этот метод не зависит от лабораторных объектов и могут быть легко использованы в любом месте (например, в полевых госпиталях, в стационарах изоляции, или с ограниченными ресурсами). Метод извлечения NA быстрый и простой и может использоваться непосредственно в любой течению NA тесты, такие как RT-лампа, лампа, ПЦР и RT-ПЦР. Когда этот метод извлечения NA сочетается с лампой и портативный аккумулятор driven изотермический инструмент, прикроватные диагноз можно получить в течение 40 мин сбора крови.

Protocol

Комитет по этике биомедицинских исследований, столичный регион дал согласие, и все методы, описанные здесь были освобождены от обзора по системе этического Комитета, в соответствии с датского Закона о анализа проектов в области развития. 1. Подготовка вакуумной пробирки д…

Representative Results

Протокол, представленные здесь проста и эффективна и может широко применяться к любой молекулярных пробирного выполняться на образцах инфекционных цельной крови, инактивированная с буфера lysis/привязки. Рабочий процесс инактивации крови и NA добыча показано на <strong class…

Discussion

В настоящем докладе мы описываем безопасной, быстрой и простой ручной прикроватные NA извлечения метод для вниз по течению молекулярной обнаружения вируса в крови целом инактивированная буфера lysis/привязки. Описан метод извлечения NA был разработан непосредственно на пробах цельной кр?…

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Сюзанна Лопес Расмуссен и Солвэй Kolbjørn Дженсен за их технической помощи и для обработки клинических образцов. Этот проект является частью EbolaMoDRAD консорциум, который получил финансирование от инновационной медицины инициатива 2 совместное предприятие под Грант соглашение N ° 115843. Это совместное предприятие получает поддержку от Европейского союза Horizon 2020 исследований и инновационной программы и EFPIA.

Materials

Vacutainer K2 EDTA tubes (4 mL) Becton Dickinson 368861
Plus Blood Collection Becton Dickinson 362725
23G x 1 needle  Becton Dickinson 300800
LUER LOK syringe (3 mL) Becton Dickinson 309658
Butterfly needle with small-bore extension tubing Jørgen Kruuse A/S 121714
1% Virkon  Nomeco A/S 849265
MagNA Pure LC DNA Isolation Kit I – Lysis/Binding Buffer – Refill Roche Diagnostics A/S 03246752001
MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit Roche Diagnostics A/S 3038505001
Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (1,8 mL)  Thermo Fisher Scientific 375418
Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (3,6 mL)  Thermo Fisher Scientific 379189
Nunc™ Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes (4,5 mL) Thermo Fisher Scientific 379146
DynaMag™-5 Magnet Thermo Fisher Scientific 12303D
Transfer pipette (3.5 mL) Sarstedt 86.1171.010
Thermo Scientific™ Samco™ Fine Tip Transfer Pipettes (1.5 mL) Thermo Fisher Scientific 231
Thermo Scientific™ Nunc™ 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 339652

Referanslar

  1. Lee, D., Shin, Y., Chung, S., Hwang, K. S., Yoon, D. S., Lee, J. H. Simple and Highly Sensitive Molecular Diagnosis of Zika Virus by Lateral Flow Assays. Analytical Chemistry. 88, 12272-12278 (2016).
  2. Benzine, J. W., Brown, K. M., et al. Molecular Diagnostic Field Test for Point-of-Care Detection of Ebola Virus Directly from Blood. Journal of Infectious Diseases. 214 (Suppl 3), S234-S242 (2016).
  3. Faye, O., Faye, O., et al. Development and deployment of a rapid recombinase polymerase amplification Ebola virus detection assay in Guinea in 2015. Euro Surveillance. 20 (44), 10-18 (2015).
  4. Yang, M., Ke, Y., et al. Development and Evaluation of a Rapid and Sensitive EBOV-RPA Test for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Disease. Scientific Reports. 6, (2016).
  5. Smither, S. J., Weller, S. A., et al. Buffer AVL alone does not inactivate Ebola virus in a representative clinical sample type. Journal of Clinical Microbiology. 53 (10), 3148-3154 (2015).
  6. Byrnes, S., Fan, A., et al. A Portable, Pressure Driven, Room Temperature Nucleic Acid Extraction and Storage System for Point of Care Molecular Diagnostics. Analytical Methods. 5 (13), 3177-3184 (2013).
  7. Rosenstierne, M. W., Karlberg, H., et al. Rapid bedside inactivation of Ebola virus for safe nucleic acid tests. Journal of Clinical Microbiology. 54 (10), 2521-2529 (2016).
  8. Vinner, L., Fomsgaard, A. Inactivation of orthopoxvirus for diagnostic PCR analysis. Journal of Virological Methods. 146, 401-404 (2007).
  9. Schmitz, H., Köhler, B., et al. Monitoring of clinical and laboratory data in two cases of imported Lassa fever. Microbes and Infection. 4 (1), 43-50 (2002).
  10. De La Vega, M. A., Caleo, G., et al. Ebola viral load at diagnosis associates with patient outcome and outbreak evolution. Journal of Clinical Investigation. 125 (12), 4421-4428 (2015).
  11. Hasanoglu, I., Guner, R., et al. Dynamics of viral load in Crimean Congo hemorrhagic fever. Journal of Medical Virology. 90 (4), 639-643 (2017).
  12. Biava, M., Colavita, F., et al. Evaluation of a rapid and sensitive RT-qPCR assay for the detection of Ebola Virus. Journal of Virological Methods. 252, 70-74 (2018).
  13. Fernández-Carballo, B. L., McBeth, C., et al. Continuous-flow, microfluidic, qRT-PCR system for RNA virus detection. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 410 (1), 33-43 (2017).
  14. Weller, S. A., Bailey, D., et al. Evaluation of the Biofire FilmArray Biothreat E-test (v2.5) for rapid identification of Ebola virus disease in heat-treated blood samples obtained in Sierra Leone and United Kingdom. Journal of Clinical Microbiology. 54 (1), 114-119 (2015).
  15. Semper, A. E., Broadhurst, M. J., et al. Performance of the GeneXpert Ebola Assay for Diagnosis of Ebola Virus Disease in Sierra Leone: A Field Evaluation Study. PLoS Medicine. 13 (3), e1001980 (2016).
  16. Biocartis. . Instructions for Use: Idylla TM Ebola Virus Triage Test. , (2016).
  17. MPLC. . Total Nucleic Acid Isolation Kit. Safety data sheet version 1.7. , (2015).

Play Video

Bu Makaleden Alıntı Yapın
Rosenstierne, M. W., Jensen, C. E., Fomsgaard, A. Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples. J. Vis. Exp. (136), e58001, doi:10.3791/58001 (2018).

View Video