Extração rápida, segura e simples Manual cabeceira de ácidos nucleicos para a detecção de vírus em amostras de sangue total

Em situações de surto de vírus, quando os pacientes estão confinados para as enfermarias de isolamento ou quando houver necessidade de um diagnóstico rápido, um seguro, simples e preciso diagnóstico molecular do point-of-care é imperativo para a contenção de cuidados e risco de paciente. Os dois surtos virais recentes, do vírus Ebola (EBOV) na África Ocidental (2013) e o vírus Zika na América do Sul (2015), aumentaram o interesse na melhoria point-of-care molecular testes de diagnóstico, tais como isothermal mediada por laço de transcrição reversa amplificação (RT-lâmpada)^1,2 e recombinase polimerase amplificação (RPA)^3,4. RT-lâmpada tanto RPA são testes moleculares rápidos, sensíveis e específicas que podem ser executadas em preparações de amostra simplificada. Para o vírus Zika, RT-lâmpada foi combinada com um ensaio de fluxo lateral (LFA), que pode detectar vírus Zika em amostras de sangue não-purificada dentro de 30 min¹; no entanto, para EBOV, que é classificado como um patógeno do grupo 4 de risco e é altamente contagiosa, as amostras precisam ser manipuladas em Biossegurança de nível 4 (BSL-4) condições e inativado antes de quaisquer procedimentos de diagnósticos seguros podem ser realizados.

Métodos de inativação simplificado para EBOV, tais como a adição de buffers de Lise para a amostra^2,3,4,5, foram utilizados durante o surto; no entanto, esses métodos requerem tratamento em condições de BSL-4 com equipamentos de laboratório, tais como armários de biossegurança BSL-3, centrífugas, blocos de aquecimento e pipetas, no mínimo. Este equipamento normalmente não está presente em enfermarias de isolamento ou em hospitais de campanha. Para superar este desafio, foram feitas tentativas para executar diagnósticos em malas³, e vários dispositivos portáteis e máquinas foram desenvolvidos [por exemplo, um dispositivo portátil para extração de ácidos nucleicos (at)]⁶. No entanto, amostras de EBOV-positivo ainda precisam ser inativado antes que estes dispositivos podem ser usados.

Temos anteriormente relatado um método de inativação de vírus cabeceira rápida para o EBOV⁷, vírus Vaccinia e Cowpox vírus⁸ pela adição de um tampão de Lise/ligação comercial para tubos de colheita de sangue vácuo ordinário, permitindo o direto transferência de sangue do paciente para a inactivação de tampão⁷. Esta inativação directa e imediata, em um sistema fechado elimina a necessidade para a manipulação das amostras usando qualquer confinamento rigoroso, tais como condições de BSL-4⁷, e as amostras podem ser manipuladas em condições normais de BSL-2. Este método de inativação é compatível com vários sistemas de extração de at, tais como robôs e kits de purificação mão⁷; no entanto, esses métodos exigem equipamento de laboratório, como robôs, centrifugadores e eletricidade, que não estão sempre presentes em configurações do campo ou dentro de enfermarias de isolamento.

Neste relatório, descrevemos um seguro, rápido e simplificado NA extração método manual para detecção molecular subsequente de um vírus no sangue de inteiro inactivadas tampão lise/vinculação. O método de extração de at não exige qualquer equipamento que não seja um suporte magnético/imã. Não centrifugadores, blocos, ou eletricidade de aquecimento são necessários para a extração de at. Portanto, esse método não é dependente de instalações laboratoriais e pode facilmente ser usado em qualquer lugar (por exemplo, em hospitais de campanha, em enfermarias de isolamento, ou com as configurações de recursos Baixos). O método de extração de nd é rápida e simples e pode ser usado diretamente em qualquer testes de at a jusante, tais como qPCR, RT-qPCR, lâmpada ou RT-lâmpada. Quando este método de extração de at é combinado com a lâmpada e um instrumento isotérmico orientado a bateria portátil, um diagnóstico de cabeceira pode ser obtido dentro de 40 min da coleta de sangue.