Analyse der N- Glykane von Raphanus Sativus Sorten verwenden PNGase H⁺

N– Glykane in Pflanzen haben erhöhte Aufmerksamkeit in den letzten Jahren gezogen, wie die bisherige Forschung N– Glykane als eine potenzielle Quelle für immunologische Kreuzreaktionen hervorhob, die allergische Reaktionen^{1,2 provozieren kann} . Es nachweislich bereits, dass N– Glykane auf Pflanze Glykoproteine katalytische Aktivität^3,4, Thermostabilität und klappbare^5,6 oder subzelluläre Lokalisierung beeinflussen kann und Sekretion⁷. Um die Glycan-Strukturen mit ihren jeweiligen Funktionen zu korrelieren, muss N– Glykane zuerst aus Glykoproteinen entweder chemisch oder enzymatisch entlassen werden. Die klassische chemische Methode für die Freigabe von N– und O– Glykanen ist β-Eliminierung, in denen alkalische Probenbehandlung durch Reduktion mit Natriumborhydrid ein Alditol⁸weichen begleitet wird. Jedoch dieses Verfahren schließt mit einem Fluorophore beschriften und verursacht erhebliche Verfall der Monosaccharid-Einheiten aus der reduzierenden Ende der Glycan Struktur. Chemische Deglycosylation basierend auf Ammonium Hydroxid/Carbonat Behandlung ist auch eine häufig verwendete alternative Methode⁹. Keines dieser Verfahren chemische Freisetzung verschlechtert intakte Proteine, die massenspektrometrische Analyse der unbeschrifteten Glycan Pools ohne die Einmischung von Peptid-Fragmente in den gleichen Massenbereich ermöglicht. Ein Nachteil dieser Methoden ist jedoch die erhöhte Abbaurate von α1, 3-Fucosylated N– Glykane, eine gemeinsame Struktur der Kohlenhydrate in Pflanzen¹⁰gefunden. Alternativ, enzymatischen Freisetzung von Methoden mit Peptid:N– Glycanases (PNGases, EC 3.5.1.52) werden auch eingesetzt. Rekombinante PNGase F (von Flavobacterium Meningosepticum) ist die häufigste Wahl und erlaubt die Freigabe aller Arten von N– Glykanen, außer die Strukturen mit einem Kern α1, 3 Fucose^11,12. PNGase A (isoliert aus Mandel Samen) ist daher in der Regel für die Analyse der Anlage N– Glykane¹³verwendet. Jedoch dieses Enzym Deglycosylates nur proteolytisch abgeleitete Glykopeptide, und ist nicht in der Lage, Deglycosylate native Glykoproteine¹⁴. Daher ist eine mehrstufige Probe Aufarbeitung vor weiteren Analyse erforderlich, die umfangreichen Verlust von Glykoproteinen, insbesondere der niedrige Fülle¹⁵führt. Das übergeordnete Ziel der Methode ist, einen optimierten Arbeitsfluss für N– Glycan Release und Fluoreszenz-Beschriftung in eine einfache und robuste Art und Weise zu präsentieren. Die zugrunde liegende Logik ist, dass PNGase H⁺, das war vor kurzem in Terriglobus Roseus entdeckt und in E. Colirekombinant ausgedrückt werden kann, können N– Glykane direkt aus dem Protein-Gerüst in sauren hydrolyseneigung Bedingungen-¹⁶. Ein entscheidender Vorteil der Verwendung von PNGase H⁺ gegenüber alternativen Methoden ist, dass fluoreszierende Kennzeichnung Reaktionen in der selben Reaktionsgefäß durchgeführt werden können, ohne die Reaktion Puffer^17,18. Die einfache Zubereitung Bedingungen und hohe Rückgewinnung von niedrig-Fülle Oligosaccharide machen diese Methode ein wertvolles Werkzeug in der Analyse von N– Glykanen. Dieses Protokoll eignet sich für die Analyse der N– Glykane von verschiedenen Pflanzenarten.