Rastreio de biblioteca superexpressão de acasalamento-baseado no fermento

A brotamento de levedura Saccharomyces cerevisiae tem sido amplamente utilizada em pesquisa científica básica¹ compreender processos celulares diretamente relacionados a doenças humanas. Além disso, ela tem sido usada como um organismo modelo para estudar proteínas humanas associadas a doenças, tais como aquelas ligadas a doenças neurodegenerativas mais comuns, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e amiotrófica Esclerose lateral (ALS)². Uma vantagem do modelo de levedura é a facilidade com que uma tela de todo o genoma pode ser realizada para identificar caminhos celulares relacionados à toxicidade de doença relacionada com proteínas, dando assim a visão sobre o mecanismo de sua toxicidade. Um tal tela chama-se uma tela de biblioteca superexpressão, em que cada um dos 5.500 genes fermento em uma biblioteca de matriz é transformado em um modelo de levedura para identificar quais genes podem modificar toxicidade quando overexpressed. Este método de triagem foi aplicado com sucesso nos modelos de levedura de múltiplos neurodegenerativas associadas a doença proteínas, incluindo huntingtina para a doença de Huntington³, α-synuclein para a doença de Parkinson^4,5 , Aβ para a doença de Alzheimer,⁶e FUS e TDP-43 para ALS^7,8,9. Enquanto é feito geralmente em uma maneira do elevado-throughput¹⁰, o passo mais trabalhoso da tela está transformando individualmente 5.500 genes fermento de uma biblioteca de matriz. Esta etapa deve ser executada cada vez que o rastreio é repetido, e sempre que um modelo de levedura recém-criada precisa ser estudado. É importante encontrar uma maneira mais eficiente para realizar essa tarefa.

Células de levedura podem existir estàvel em formas haploides e diploides. Há dois opostos acasalar tipos de células haploides, tipo de acasalamento um e α. células haploides de cada acasalamento tipo produzem e secretam seu próprios pheromone acasalamento específico, ao qual apenas as células acasalamento tipo oposto respondem. Isso permite que o acasalamento entre um e células α para produzir células diploides estáveis, a/α. Este processo é espontânea e altamente eficiente de¹¹. Que pode tirar proveito deste exclusivo do ciclo de vida de S. cerevisiae para introduzir a biblioteca do plasmídeo. Mais especificamente, cada gene na biblioteca do plasmídeo matriz será transformado em células haploides de um tipo de acasalamento, isto é, células α. Estas células que contêm os genes de biblioteca serão então armazenadas em estoque de glicerol em formato matriz de 96 poços. Para cada modelo de fermento que precisa ser rastreada, células de levedura contendo os genes de biblioteca podem ser descongeladas partir do estoque de glicerol, e o rastreio pode ser feito através de acasalamento com o modelo de leveduras de interesse o acasalamento tipo oposto, ou seja, acasalamento tipo um. A ideia de usar o acasalamento para reunir dois genes em fermento não é nova. Foi aplicado com sucesso no fermento do elevado-throughput rastreio do dois-híbrido, em que uma isca construir (ou seja, fusões de domínio Gal4-DNA-binding) em um tipo de acasalamento é reuniu através de acasalamento com uma presa de construção de uma biblioteca de matriz ¹². no entanto, essa estratégia nunca foi aplicada em seleções de biblioteca superexpressão, que sempre usaram métodos de transformação tradicional.

Nosso laboratório anteriormente estabelecido um modelo de levedura do ALS-associada da proteína FUS⁷. Descobrimos que cinco genes de levedura(ECM32, NAM8, SBP1, SKO1e VHR1) que resgatar a toxicidade de FUS quando overexpressed através de triagem de superexpressão biblioteca usando o método de transformação. Estes resultados foram confirmados independentemente com um estudo semelhante por outro grupo⁸. hUPF1, um homólogo humano de ECM32, mostrou-se mais tarde para suprimir a toxicidade em células neuronais primária¹³ e em um modelo animal de ALS¹⁴ também. Usando estes cinco genes como prova de princípio, vamos demonstrar que todos os cinco genes da mesma forma resgatar toxicidade FUS quando são introduzidos no modelo de levedura FUS por acasalamento. Uma vez que as células de levedura contendo os genes de biblioteca podem ser armazenadas permanentemente em estoque de glicerol e revividas sempre que necessário, este método baseado em acasalamento removerá a etapa demorada de transformação cada vez que a biblioteca precisa ser protegidos contra. Desde que o acasalamento é altamente eficiente com nenhuma transformação do plasmídeo envolvida, esta estratégia também significativamente diminui o custo associado a purificação e a transformação de uma biblioteca grande plasmídeo. Vamos com êxito aplicar este método em uma biblioteca de triagem contra modelo de levedura de FUS.

O procedimento para a seleção com base em acasalamento é brevemente descrito na Figura 1. Inicialmente, a biblioteca de matriz do plasmídeo é transformada em uma cepa de levedura haploide de acasalamento tipo α usando um protocolo de transformação de levedura de alta produtividade em que cada poço de uma placa de 96 poços contém fermento transformado com um plasmídeo de biblioteca específica. Esta coleção de fermento transformado é salvo como um estoque de glicerol que pode ser descongelado e ressuscitado para uso mais tarde. O modelo de leveduras de interesse, na toxicidade FUS neste caso, deve ser gerado em uma cepa de levedura haploide com o tipo oposto de acasalamento (tipo de acasalamento um). De forma elevado-throughput usando estéril 96 pinos replicadores, a estirpe FUS e cepas de leveduras contendo a biblioteca do plasmídeo são transferidas para placas de 96 poços contendo mídia rica e permissão para companheiro. Após o acasalamento, um pequeno volume de cada poço de cultura acasalamento é transferido para placas de 96 poços contendo mídia desistente sintético no qual fermento apenas diploide que contém ambos os FUS e genes de biblioteca podem crescer. Uma máquina robótica spotting é usada para transferência de cultura de levedura de cada poço em placas de ágar, onde a expressão de FUS e os genes de biblioteca é induzida.  Além disso, a cultura de levedura está manchada para controlar placas de ágar, onde FUS e os genes de biblioteca não são expressos. Após crescimento em placas de ágar, serão identificados os genes que resgatar ou exacerbam a toxicidade FUS.