Sondando a célula mecânica com pinça óptica de grânulo-livre no embrião da drosófila

Desenvolvimento embrionário é um processo altamente reprodutível, durante o qual as células e os tecidos se deformam para moldar o futuro animal. Tais deformações foram mostradas para exigir a geração ativa de forças no celular nível^1,2. Para compreender processos morfogenéticas, durante o qual as células e tecidos mudam a sua forma, é, portanto, chave para avaliar as propriedades mecânicas das células envolvidas e para medir as forças dentro do tecido durante o processo de^3,4 . Epitelial, especialmente em Drosophila, têm sido amplamente estudados devido a sua geometria quase-2D e à sua fácil manipulação.

Um número de técnicas, portanto, foram desenvolvido por nós e outros para avaliar mecânica epitelial na vivo durante o desenvolvimento. Vamos dar uma rápida visão geral dos três principais técnicas usadas em tecidos epiteliais. Ablação a laser, um método amplamente usado, permite revelar o estresse mecânico local na célula junções^5,6,7,8 ou em maior escala^9,10,11 através da realização de cortes locais que interrompem a integridade mecânica do alvo. A dinâmica da abertura do corte a seguir fornece informações tanto na ablação prévia de stress e sobre a reologia do tecido^12,13. Uma desvantagem da ablação a laser é que é invasivo, como exige a ruptura local do córtex celular. Daí, um só pode executar um número limitado de ablações se você quiser preservar a integridade do tecido. Outra desvantagem é que ablações só fornecem estimativas relativas da tensão em contatos de celular, desde que a velocidade de abertura depende de atrito viscoso, o que geralmente não é conhecido. Manipulação magnética também foi desenvolvida e usada em Drosophila, envolvendo o uso de Ferrofluidos¹⁴ ou lipossomas ultramagnetic¹⁵. Eles podem fornecer medições absolutas^16,17, mas também são invasoras no sentido de que eles requerem a injeção de sondas no local desejado. Isto pode ser muito complicado dependendo do sistema, que não é sempre passível de injeções precisas. Uma terceira técnica, totalmente não-invasivo, é força inferência^18,19,20. Força de inferência se baseia na suposição de equilíbrio mecânico em pontos triplos (fialoconídios entroncamentos ou vértices) e permite inferir as tensões em todos os celular contatos (e possivelmente, pressões em todas as células) por resolver um problema inverso. Para tensões, cada vértice fornece duas equações (X e Y). Isso resulta em um grande sistema de equações lineares que pode ser invertido sob algumas condições para avaliar a tensão em todos os contatos do celular. Enquanto este método é muito atraente, como não exige somente uma imagem segmentada e nenhuma experiência extra ou instalação, sua precisão é ainda a determinar, e novamente apenas fornece valores relativos, a menos que uma medida absoluta da calibração é executada.

Para superar algumas destas limitações, apresentamos neste artigo uma instalação da pinça óptica acoplado a um microscópio de luz folha aplicar forças controladas na escala celular no epitélio embrionário da Drosophila melanogaster. Pinça óptica têm sido utilizada para numerosas aplicações biológicas, incluindo as medições em proteínas simples e manipulação de células e organelas²¹. Aqui, nós relatamos as forças aplicadas na faixa de uns dúzia de pN, que é pequena, ainda suficientes para induzir deformações locais de contatos do celular e realizar medições mecânicas na vivo. Normalmente, usamos perpendicular deflexão de contatos do celular, monitorada através da análise de kymographs, para relacionar força-deformação. Importante, nossa configuração não exige a injeção de grânulos no local desejado no tecido, como Pinça óptica é capaz de exercer directamente forças nos contatos do celular. A atrelar a Pinça óptica para um microscópio de luz folha permite realizar imagens rápidas (vários quadros por segundo), que é muito sensível para uma análise mecânica em escalas de tempo curto e com reduzida fototoxicidade, desde a iluminação da amostra é limitada ao plano da imagem latente de²².

Globalmente, ópticas pinças são uma maneira não-invasiva para aplicar forças controladas em contatos do celular em in vivo, o embrião da drosófila e extrair informações mecânicas, tais como rigidez e tensão na célula contatos²³, propriedades reológicas ²⁴e gradiente ou anisotropia da tensão²³.