Palpage mécanique cellulaire avec des pinces optiques exempt de perle dans l’embryon de drosophile
Özet
Nous présentons un programme d’installation de pinces optiques couplées à un microscope de nappe de lumière et sa mise en œuvre pour sonder la mécanique cellulaire sans billes dans l’embryon de drosophile .
Abstract
Morphogenèse nécessite une coordination entre la structuration génétique et des forces mécaniques à façonner avec force les cellules et les tissus. Un défi de comprendre les processus morphogénétiques est donc de mesurer directement les forces cellulaires et propriétés mécaniques in vivo au cours de l’embryogenèse. Nous présentons ici une configuration de pinces optiques couplées à un microscope de nappe de lumière, qui permet d’appliquer directement les forces sur les contacts des cellules de l’embryon de drosophile au début, tout en imagerie à une vitesse de plusieurs images par seconde. Cette technique a l’avantage qu’il ne nécessite pas l’injection de perles dans l’embryon, habituellement utilisé comme sondes intermédiaires sur lequel sont exercent les forces optiques. Nous détailler étape par étape la mise en œuvre de l’installation et proposer des outils pour extraire des informations mécaniques à l’expérimentation. En surveillant les déplacements des contacts de cellules en temps réel, on peut effectuer des mesures de tension et d’enquêter sur la rhéologie des contacts cellule.
Introduction
Le développement embryonnaire est un processus hautement reproductible au cours de laquelle les cellules et les tissus se déforment pour façonner le futur animal. Ces déformations ont démontré que nécessitent la génération active des forces à la cellule de niveau1,2. Pour comprendre les processus morphogénétiques au cours de laquelle les cellules et les tissus changent leur forme, il est donc essentielle pour évaluer les propriétés mécaniques des cellules impliquées et pour mesurer les forces dans les tissus durant le processus3,4 . Les couches épithéliales, surtout chez la drosophile, ont été largement étudiés en raison de leur géométrie quasi-2D et à leur manipulation facile.
Un certain nombre de techniques ont donc été mis au point par nous et d’autres pour évaluer épithéliales mécanique in vivo au cours du développement. Nous allons donner un aperçu rapide des trois principales techniques utilisées dans les tissus épithéliaux. Ablation de laser, une méthode largement utilisée, permet de révéler les contraintes mécaniques locales à cellules jonctions5,6,7,8 , ou à plus grande échelle9,10,11 en effectuant des coupes locales qui perturbent l’intégrité mécanique de la cible. La dynamique de l’ouverture après la coupe fournit des informations sur l’ablation préalable de stress et sur la rhéologie des tissus12,13. L’inconvénient de l’ablation laser est qu’il est envahissante, car elle exige la perturbation locale du cortex cellulaire. Par conséquent, on ne peut effectuer un nombre limité d’ablations si l’on veut préserver l’intégrité des tissus. Un autre inconvénient est que les ablations seulement des estimations relatives de tension aux contacts cellulaires, puisque la vitesse d’ouverture dépend de frottement visqueux, ce qui n’est généralement pas connue. Manipulation magnétique a également été développée et utilisée chez la drosophile, impliquant l’utilisation de garnissages14 ou liposomes ultramagnetic15. Ils peuvent fournir des mesures absolues16,17, mais sont aussi envahissantes en ce sens qu’ils nécessitent l’injection des sondes à l’endroit désiré. Cela peut être très difficile selon le système, ce qui n’est pas toujours favorable aux injections précises. Une troisième technique, totalement non invasive, est force inférence18,19,20. Inférence de force repose sur l’hypothèse d’équilibre mécanique à triples points (jonctions tricellular, ou des sommets) et permet d’en déduire les tensions à toutes les cellules contacts (et éventuellement, les pressions dans toutes les cellules) de résoudre un problème inverse. Pour les tensions, chaque sommet a fournit deux équations (X et Y). Cela donne un grand système d’équations linéaires qui peuvent être inversés dans certaines conditions afin d’évaluer la tension à tous les contacts de la cellule. Alors que cette méthode est très séduisante, car elle ne nécessite seulement une image segmentée et aucune expérience supplémentaire ou configuration, sa précision est encore à déterminer, et encore une fois il fournit seulement des valeurs relatives, à moins qu’une mesure d’étalonnage absolu est effectuée.
Pour remédier à certaines de ces limitations, nous présentons dans cet article une configuration de pinces optiques couplée à un microscope de nappe de lumière pour appliquer des forces contrôlées à l’échelle de la cellule dans l’épithélium embryonnaire de Drosophila melanogaster. Des pinces optiques ont été utilisés pour de nombreuses applications biologiques, y compris les mesures sur des protéines simples et manipulation des cellules et organites21. Nous rapportons ici les forces appliquées dans l’ordre de quelques pN douzaines, ce qui est petit encore suffisant à provoquer des déformations locales de contacts cellule mécanique mesures in vivo. En général, nous utilisons déviation perpendiculaire des contacts cellulaires, surveillés par le biais de l’analyse de kymographs, faire le pour lien entre la force de déformation. Important, notre programme d’installation ne nécessite pas l’injection de perles à l’emplacement désiré dans le tissu, comme des pinces optiques sont en mesure d’exercer directement les forces de contacts cellule-cellule. L’accouplement des pinces optiques d’un microscope de nappe de lumière permet d’effectuer l’imagerie rapide (plusieurs images par seconde), qui est très appréciable pour une analyse mécanique à des échelles de temps court et avec la phototoxicité réduite, depuis l’éclairage de la échantillon est limitée au plan de l’imagerie22.
Pince à épiler dans l’ensemble, les optiques est un moyen non invasif d’appliquer des forces contrôlées aux contacts cellulaire in vivo chez l’embryon de drosophile et pour extraire des informations mécaniques tels que la rigidité et la tension à la cellule contacts23, propriétés rhéologiques 24et dégradé ou anisotropie de tension23.
Protocol
Representative Results
Discussion
Des pinces optiques permettent d’effectuer des mesures mécaniques absolues directement dans l’épithélium en développement embryonnaire d’une manière non invasive. En ce sens, elle présente des avantages par rapport aux autres méthodes telles que l’ablation de laser, qui sont envahissantes et fournissent des mesures relatives, les forces magnétiques, qui nécessitent des injections, ou forcer l’inférence, qui repose sur des hypothèses et également fournissent relative mesures.
<p class="jove_conte…Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une Equipe de FRM Grant FRM DEQ20130326509, Agence Nationale de la Recherche ANR-Blanc Grant, Morfor ANR-11-BSV5-0008 (à la P.-F.L.). Nous reconnaissons l’infrastructure France-BioImaging pris en charge par le Français National Research Agency (ANR-10-INBS-04-01, « Investissements d’avenir »). Nous remercions Brice Detailleur et Claude Moretti de l’infrastructure de PICSL et le FBI pour l’assistance technique.
Materials
| Ytterbium Fiber Laser LP, 10 W, CW | IPG Laser | YLM-10-LP-SC | including collimator LP : beam D=1.6 mm and red guide laser |
| Ø1/2" Optical Beam Shutter | Thorlabs | SH05 | |
| Small Beam Diameter Galvanometer Systems | Thorlabs | GVS001 | 1 for X displacement, 1 for Y displacement |
| 1D or 2D Galvo System Linear Power Supply | Thorlabs | GPS011 | galvanometers power supply |
| 2 lenses f = 30mm | Thorlabs | LB1757-B | relay telescope between 2 galva |
| Lens f = 200mm | Thorlabs | LB1945-B | 2.5X telescope |
| Lens f = 500mm | Thorlabs | LB1869-B | 2.5X telescope |
| Right-Angle Kinematic Elliptical Mirror Mount with Tapped Cage Rod Holes | Thorlabs | KCB1E | Periscope |
| Laser Safety Glasses, Light Green Lenses, 59% Visible Light Transmission, Universal Style | Thorlabs | LG1 | |
| 45° AOI, 50.0mm Diameter, Hot Mirror | Edmund Optics | #64-470 | |
| Multiphoton-Emitter HC 750/S | AHF | HC 750/SP | |
| CompactDAQ Chassis | National Instruments | cDAQ-9178 | |
| C Series Voltage Output Module | National Instruments | NI-9263 | Analog output module |
| C Series Voltage Input Module | National Instruments | NI-9215 | Analog input module |
| FluoSpheres Carboxylate-Modified Microspheres, 0.5 µm, red fluorescent (580/605), 2% solids | ThermoFisher Scientific | F8812 | calibration beads |
| C++ (Qt) home made optical tweezers software | developed by Olivier Blanc and Claire Chardès. Alternative solution: labview |
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