その場で測定と細胞密度の相関、発光細菌の発光

– LuxCDABFEG – luxオペロンの遺伝子順序は、さまざまな系統2,5,14で保存性が高い。プラスミッドの設計、シーケンス情報発光菌株Photobacterium mandapamensis 27561 から撮影された」とその遺伝子の順序が同じに保たれた、また、単一の遺伝子間の非コード シーケンスが考慮されました。応用ギブソン クローニング法の概要は、図 2で描かれています。シーケンスを重複 20 40 塩基対で合計、 luxCDAB、 luxF、 luxEG、 ribEBHの 4 つのフラグメントが生成されました。ギブソン アセンブリ20のすべての手順を実行した後は、DNA の配列は、すべてのフラグメントを含むプラスミドの適切なアセンブリを確認しました。リブ luxオペロンを含む最終組立製品 pET28a のベクトル マップは、図 3に描かれています。この変更された pET28a ベクターの重要な利点の使用率は、大腸菌の成長条件を標準化、IPTG と誘導を制御します。 それぞれのセル密度と発光細菌の発光を測定するには、プレート リーダーによる方法を開発しました。光強度と細胞密度の単一測定スクリプトを組み合わせるプレート リーダーのメソッドが生成されました。この新しいスクリプト有効外径650の測定、光強度のユーザーのすべての 10 分定義時間フレームは、それぞれの分析 (例えば、 10 h) に使用される細菌の世代時間を調整することに。光学濃度の測定は、650 で行われた nm 発光との干渉を避けるために。概念の健康と大腸菌の細胞の正しい成長挙動を保証するために、証拠として参照の測定を行った。図 4 大腸菌BL21 細胞、大腸菌BL21 セル空 pET28a ベクトルとリブ luxオペロンと pET28a ベクターを含む大腸菌BL21 細胞の比較で挿入が掲載されています。後者のひずみの T7 プロモーターのため、水漏れしたため発光を分析する IPTG は追加されません。すべて 3 参照測定は、3 つの成長段階 (遅れ、指数、および固定相) と s 字状の成長曲線を示します。発光にルクス リブオペロン挿入開始、測定とは対照的に、pET28a ベクターを含む大腸菌BL21 セルのみ発現が光と IPTG の添加による誘導は、非誘発細胞の 30 分後が出力されます。約 5 時間後に照らし、はるかに低い発光を示すのみで開始 (約 4 倍) 誘導システムと比較して。 図 5は、エシェリヒア属大腸菌および発光菌株P. mandapamensis 27561、LB 培地または人工的な海の水の中のいずれかで表されるluxオペロンの光強度と成長曲線の比較小説を使用してその場で法を確立しました。これらの細菌を比較するには、28 ° C の孵化の温度で測定を行った変更されたエシェリヒア属大腸菌の伸び歪 LB 培地、低温で発光菌株が、人工海水水媒体だけでなく、この温度低下は重大であります。この温度依存性は、 P. mandapamensis 27561大腸菌よりもはるかに高い細胞密度に示す図 5Aに表示されます。さらに、大腸菌、しばらく LB 培地生成可能高い細胞密度、自然発光細菌株の人工の海の水の中は最寄りと発光のために不可欠です。記録された細胞の密度は図 5Bに示すように、それぞれの光の強さと相関します。注目すべき、エシェリヒア属大腸菌の生物発光の細胞に達するような異なる時点で記録された最高の強度が両方 LB 培地として人工海水媒体の排出マキシマの光します。この観察と対照をなしてP. mandapamensis 27561 は LB 培地での非常に減らされた成長率で実行可能が細菌のセルがすべて (図 5B) の光を出さない。人工的な海の水の中は、 P. mandapamensis 27561 は大腸菌より低い 200 のほぼ要因である、1 秒あたり約 1 × 104カウントで発光の最大を示しています。図 5Cは、OD で生物発光を正規化する、相対のライト ユニットを表します。これらの結果の確認だけでなくプラスミドの挿入だったE. 大腸菌成功し、機能にluxオペロンを含む、大腸菌を変更、これも歪みがさらに高い発光を有効な代替手段得られ、複雑な海水などのマリーナ菌の細菌の生物発光の制限なく中型、低い温度。 さらに、発光 (図 6) の長寿を分析するエシェリヒア属大腸菌によるルクス肋骨遺伝子発現 24 時間以上の長期的な測定を行った。発光は、19.5 時間続いたが徐々 に減少 (例えば、P. mandapamensis 27561) 菌株より長く非常に低い発光 10 時間後の結果が観察されました。 開発分析の限界を示すためには、図 7に示します 3 つの発光細菌の緊張、すなわちPhotobacterium mandapamensis S1 Photobacterium mandapamensis TH1、ビブリオの測定結果harveyi 14126。最初のひずみ (S1)、メソッドが非常によく動作し、約 2 × 106の最大発光強度を示しています。他の 2 つの系統 (TH1 および 14126) 両方によって生成される光の強度は、使用機器の設定の検出の制限を超えたために、極大の光の強度を決定できません。これらの 2 つの系統の開発メソッド (スクリプト) に定義されているゲイン値は高すぎる設定されました。それにもかかわらず、生物発光活性の発症を相互に比較できます。P. mandapamensis TH1 とP. mandapamensis S1 開始後約 1 時間で、OD650値 0.1 が輝く – 0.2、それぞれ。対照的に、 harveyi V. 14126 1.0 の OD650値で約 5.5 時間後に光を放出し始めます。発光の観測の発症の生物発光と同様、OD の急激な増加と一緒に伴われます。V. harveyi 14126 の発光クオラムセンシング規制の基礎となる、したがって特定の細胞の密度図 713で明らかに観察することができますluxオペロンのアクティベーションを許可する知られています。この結果は、この小説はその場でプレート リーダー試験それは、発光細菌を簡単に比較しても約クオラムセンシング規制かどうかを決定することでこれらの系統の調節機構を定義があることを示してください。かどうかを観察します。 IPTG 誘導後luxオペロンを含む組み立てられた pET28a プラスミド大腸菌BL21 細胞の表現文化の例を図 8に示します。導入後約 1 時間後、大腸菌の細胞は、青緑色に輝くを開始します。図 8A 大腸菌式を示しますは、光の中で撮影した文化と図 8Bは、暗闇の中で同じ文化を与えます。図 8Cは、 P. mandapamensis S1 細菌生物発光の同じ青緑色特性の暗闇の中で光ると人工海水水媒体の寒天プレートを示しています。 図 2: クローニング戦略応用ギブソンの模式図。ステップ (I):重複プライマー (色付きの矢印; ca. 20 40 塩基対が重なっている)、設計されています。重複するプライマーは、1 つのフラグメントのそれぞれ 5′ と 3′ の地域と隣接するセグメントのそれぞれの 3′ と 5′ の領域から成る焼鈍のシーケンスを含みます。ステップ (II):標準 PCR 反応を介してアセンブリの設計のフラグメントが生成されます。ステップ (III):制限の消化力 (例えばNcoI、XhoI) によって目標のベクトルが線形化されます。ステップ (IV):すべてのフラグメントの一直線に並べられたベクトル DNA 濃度は、(製造元のプロトコル) によるとギブソン アセンブリの適切な濃度を調整する決定する必要があります。ステップ (V):すべてのフラグメントと最適化された DNA 濃度の一直線に並べられたベクトルのギブソン アセンブリ マスター ミックス (T5 エキソヌクレアーゼ、DNA ポリメラーゼおよび DNA のリガーゼ) が組み合わされて 1 h. 50 ° C で培養したのステップ (VI):アセンブリ製品の変換適切なエシェリヒア属大腸菌に標準プロトコルによると高収率プラスミド複製 (例えば、エシェリヒア属大腸菌TOP10 や XL 1) のひずみ。ステップ (VII):プラスミッドの正しい組み立ての確認、組み立てられたプラスミドの DNA の配列は、実行しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 3:ルクス リブオペロンを含む pET28a のベクター マップ。P. mandapamensis 27561 のリブ luxオペロンは、元の遺伝子順序 (luxCDABFEG ribEBH) で pET28a の多重クローニング サイトに挿入されます。XhoI と NcoI クローニングに使用制限のサイトです。オペロンのギブソン組立のフラグメントがオレンジでluxCDAB緑のluxF 、 luxEGブルー、ラベンダー; ribEBH遺伝子フラグメント内では、個別のボックスとして表示されます。各遺伝子オペロンの間非コード シーケンスは、応用のクローニング法に含まれます。全体リブ luxオペロンを含む pET28a の最終的なプラスミド サイズは 14,625 塩基対です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 4:成長曲線と指令系統の光強度の比較。OD 650 nm 1 秒あたり数の発光強度測定 28 ° C で 10 時間以上 10 分毎すべての測定は、各 4 つの技術的な複製と 3 つの生物学的複製の平均値です。エラーバーは標準偏差を表しています。エシェリヒア属大腸菌BL21 細胞 (灰色の正方形)、エシェリヒア属大腸菌BL21 セル空 pET28a ベクトル (灰色の円) および大腸菌BL21 セル pET28a ベクタールクス リブオペロン挿入 (ブラック ダイヤモンド) に行ったエシェリヒア属大腸菌細胞の正しい成長挙動を保証します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。  図 5:エシェリヒア属大腸菌(正方形)、 P. mandapamensisでluxオペロンの光強度と成長曲線の比較表現 27561 (円) LB 培地 (開いているシンボル) または人工海水水媒体 (塗りつぶされたシンボル).すべての測定は、各 4 つの技術的な複製と 3 つの生物学的複製の平均値です。エラーバーは標準偏差を表しています。28 ° C の孵化の温度ですべての実験を行った(A)光学濃度 (OD) 観測結果 650 nm は LB 培地と人工海水培地に 10 h. E. 大腸菌 luxオペロン式 (左側のパネル) P. mandapamensis 27561 (右側のパネル) と比較の 10 分毎を行った。セル密度が 650 に決定される nm 発光干渉を避けるために。(B)測定光強度 (発光 [カウント/s]) の行った 10 分毎 10 h. E. 大腸菌 luxオペロン式 (左のパネル)、LB のP. mandapamensis 27561 (右側のパネル) と比較しての中・人工の海水媒体。(C)相対光強度 (RLU/OD)エシェリヒア属大腸菌(左のパネル)、 P. mandapamensis 27561 (右側のパネル) で表されるluxオペロンの細胞密度に発光を正規化することで決定されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 6:エシェリヒア属大腸菌の光強度と成長曲線の比較による 24 時間のlux遺伝子発現OD 650 nm、1 秒あたりの数の発光強度は 10 分毎に 28 ° C で 24 時間以上を測定しました。すべての測定は、各 4 つの技術的な複製と 3 つの生物学的複製の平均値です。エラーバーは標準偏差を表しています。さらに、細胞密度によって発光の正規化、相対光強度 (RLU/OD) が表されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 7: 潜在的なクオラムセンシングで規制を評価する発光細菌の比較。発光と細胞密度 10 時間 10 分を測定し、各 4 つの技術的な複製と 3 つの生物学的複製の平均値を表します。エラーバーは標準偏差を表しています。Photobacterium mandapamensis th1 細胞の測定 (黒の正方形)、採14126 (灰色円) と (グレー ダイヤモンド) を互いに比較したPhotobacterium mandapamensis S1(A) 650 の光学濃度 (OD) を示しています nm、 (B)光強度 (発光 [カウント/s])、および(C)相対光強度 (RLU/OD)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 図 8: 発光液体メディアと寒天。(A)光で撮影 pET28a luxオペロン プラスミドを発現する大腸菌BL21 細胞を接種した 2 L LB 培地 5 L フラスコ。(B)同じカルチャ (A) のように暗闇の中で撮影します。写真 A と B の発現誘導後約 2 時間に撮影されました。(C)水培地寒天培地の暗闇の中で撮影したP. mandapamensis S1 の縞の文化人工海水。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。