Long-term <em>In Vivo</em> Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within <em>Drosophila</em> Pupae

Helen Weavers; Anna Franz; Will Wood; Paul Martin

doi:10.3791/57871

JoVE Journal > Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A longo prazo no Vivo controle da dinâmica celular inflamatória dentro drosófila pupas

Published: June 14, 2018

doi:

10.3791/57871

Helen Weavers^1,2, Anna Franz¹, Will Wood³, Paul Martin^1,4

¹School of Biochemistry, Biomedical Sciences,University of Bristol, ²School of Cellular and Molecular Medicine, Biomedical Sciences,University of Bristol, ³MRC Centre for Inflammation Research,University of Edinburgh, Queens Medical Research Institute, ⁴School of Physiology, Pharmacology, and Neuroscience, Biomedical Sciences,University of Bristol

Özet

Aqui nós apresentamos um protocolo para a reparação de ferida de geração de imagens ao vivo e a resposta inflamatória associada à alta resolução espaço-temporal na vivo. Este método utiliza o estágio de pupa de Drosophila desenvolvimento para habilitar a longo prazo de imagem e rastreamento de populações de células específicas ao longo do tempo e é compatível com a inativação de genes mediada por RNAi eficiente.

Abstract

Durante a rápida resposta inflamatória ao dano tecidual, células do sistema imunológico inato são rapidamente recrutadas para o local da lesão. Uma vez na ferida, células do sistema imune inatas realizar um número de funções essenciais, tais como o combate à infecção, limpando os restos necróticos e estimulando a deposição de matriz. Para melhor entender os eventos de sinalização diversos que regulam esta resposta imune, é crucial observar os comportamentos complexos de (e interações que ocorrem entre) várias células linhagens in vivo e em tempo real, com a alta resolução espaço-temporal. A translucidez óptico e a rastreabilidade genética de embriões da drosófila estabeleceram drosófila como um modelo de valor inestimável para viver-imagem e dissecam aspectos fundamentais do comportamento de células inflamatórias, incluindo mecanismos de dispersão do desenvolvimento, liberação de corpos apoptotic e/ou patógenos microbianos e recrutamento para feridas. No entanto, trabalhos mais recentes agora demonstrou que empregar um estágio muito posterior do ciclo de vida de drosófila – a pupa drosófila – oferece uma série de vantagens distintas, incluindo eficiência melhorada de RNAi, mais longa períodos, de imagem e significativamente maior número de células imunes. Aqui descrevemos um protocolo para o reparo de ferida de imagens e a resposta inflamatória associada com a alta resolução espaço-temporal em pupas de Drosophila ao vivo. Para acompanhar a dinâmica de re-epitelização e inflamação, usamos um número específico no vivo marcadores fluorescentes para o epitélio e células do sistema imunológico inatas. Nós também demonstrar a eficácia da foto-conversível fluorophores, tais como Kaede, por seguir os subconjuntos de célula imune específica, para controlar seu comportamento como migram para e resolver partir, local da lesão.

Introduction

Uma resposta inflamatória eficaz e eficiente é crucial para qualquer organismo combater a infecção, limpar escombros e orquestrar a reparação de tecidos feridos¹. Embora esta resposta é um resultado inevitável de maior dano de tecido, inflamação requer uma regulamentação estrita porque uma resposta inflamatória inadequada tem sido associada a uma variedade de diferentes doenças humanas (incluindo não-cura feridas crônicas, excessivo de cicatrizes e predisposição ao câncer)¹^,²^,³. Dada esta relevância clínica, é crucial obter uma compreensão mais detalhada dos mecanismos moleculares e celulares de condução a resposta inflamatória, a fim de desenvolver novos indicadores prognósticos e estratégias para tratar uma variedade de crônica inflamatória condições, que podem proteger a reparação de tecidos de inflamação prolongada e desnecessária.

Nos últimos anos, a Drosophila tornou-se um sistema bem estabelecido e valioso modelo para dissecar as características fundamentais da resposta inflamatória conservada de insetos para humano⁴^,⁵. Actualmente, a drosófila oferece rastreabilidade genética muito maior do que é actualmente possível em outros modelos experimentais (como ratos ou zebrafish), permitindo a manipulação genética espácio-temporais precisos na vivo (para inactivar ou excesso expressar qualquer gene de interesse dentro de tipos de células específicas em um tempo-ponto do desenvolvimento definido) e facilidade de todo o genoma telas⁶^,⁷. Tradicionalmente, a maioria das imagens ao vivo da cicatrização da ferida e inflamação na Drosophila foram efectuados estudos em estágios embrionários, como embriões são opticamente translúcido e imóvel (ao contrário de Drosophila larvas ou adultos) que permite inigualável de alta resolução na vivo de imagem⁸. Isto permitiu que os pesquisadores a visualização rápido e robusto recrutamento de células do sistema imune inatos drosófila (hemócitos) para o local da ferida, em resposta a ferimentos mecânicos ou induzida por laser para o epitélio embrionário⁹^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² ^, ¹³ ^, ¹⁴. combinando estes estudos de imagem ao vivo com a manipulação genética, estudos em embriões da drosófila tem descoberto muitas proteínas importantes células imunes que controlam o comportamento de células inflamatórias em vivo. Por exemplo, o homólogo do CED-1 Draper (uma ITAM domínio-contendo proteínas) foi identificado como uma importante «receptor de dano» que medeia as células imunitárias drosófila de recrutamento em um H₂O₂-forma dependente de sites de danificar a¹⁵. Níveis de Draper dentro de células do sistema imunológico são por sua vez regulados pela induzida por cálcio sinalização JNK e elevado a jusante de apoptotic cadáver captação¹². Motilidade hematócito mais requer complexas alterações do citoesqueleto para coordenar a migração dirigida para a ferida e é dependente na atividade dos reguladores do citoesqueleto tais como a actina-empacotamento proteína Fascin¹⁶ e a família Rho pequena As GTPases Rac e Rho⁹.

Drosófila é um inseto holometábolos que atravessa os estágios larvas e pupal adicionais embriogênese, antes de atingir a idade adulta¹⁷a seguir. A pupa drosófila foi desenvolvida como um modelo adicional para a não-invasiva ao vivo-imagem latente de uma variedade de eventos celulares dinâmicos, incluindo divisão celular¹⁹de migração no desenvolvimento celular¹⁸, crescimento de célula²⁰e músculo contração de²¹. Mais recentemente, ele foi estabelecido como um novo modelo em que para estudar a dinâmica da ferida reparo e inflamação na vivo²²^,²³.

Assim como em estágios embrionários, Drosophila pupas são imóveis e opticamente translúcido, após dissecção cuidadosa de seus casos pupal opaco¹⁸. Explorando essa transparência óptica, um pode seguir o comportamento na vivo de células do sistema imune inatos (hemócitos) em resposta ao dano de tecido dentro drosófila pupal tecidos, tais como a asa pupal²². A ala pupal existe como uma estrutura de bilayered simples, consistindo de dois grandes folhas plana epiteliais que estão conectadas em torno da periferia da asa; o espaço extracelular entre estas duas camadas epiteliais está repleto de hemolinfa (sangue inseto) e um grande número de hemócitos motile²⁴. Assim como em embriões, ferimentos mecânicos ou induzida por laser para o epitélio da asa desencadeia um rápido recrutamento de hemócitos a lesão local²³. No entanto, nesta fase pupal oferece algumas vantagens distintas para a imagem latente sobre anteriormente estágios embrionários. Pupas lesionadas podem ser imaginadas durante períodos de tempo muito mais longos (pelo menos 5 h), mais área de tecido está disponível para a perturbação experimental (tais como a geração de múltiplos ferimentos) e há um número significativamente maior de hemócitos presentes no (fase fornecendo mais trajetórias de célula de distâncias mais potência estatística melhorada durante a análise matemática). Além disso, a eficiência de inativação de genes mediada por RNAi é consideravelmente melhorada em estágios pupal, permitindo que muitos genes ser ‘knocked-down’ em um tecido ou o modo de tempo específico, em comparação com a abordagem mais tradicional de todo mutante de embriões.

Para seguir a dinâmica da ferida re-epitelização e a resposta inflamatória que acompanha dentro deste novo modelo pupal, duas populações de células diferentes devem ser rotuladas: o epitélio pupal e as células do sistema imunológico inatas (Drosophila hemócitos). Um número de diferentes marcadores (Tabela de materiais) está disponível para rotular estas duas populações de células diferentes – a escolha do marcador varia de acordo com o processo específico a ser estudado. Para marcar o epitélio pupal, linhas de Drosophila , contendo também um ubiquitously expressa GFP-com a tag E-caderina (que rotula entroncamentos adherens) rotineiramente são utilizados para indicar as posições das margens de célula, ou alternativamente, um GFP-etiquetado Domínio de ligação de actina de Moesin (que rotula o citoesqueleto de actina) para visualizar as saliências de anel e ponta de ferida-borda contrátil actina. Para rotular os hemócitos de Drosophila , um específico hematócito srp-Gal4²⁵ a expressão de unidade de RFP nuclear (para rastreamento nuclear), GFP citoplasmática ou GFP-etiquetado Moesin (para rotular o citoesqueleto citoplasma ou actina, respectivamente) ou um fluoróforo photoconvertible (tais como Kaede) são utilizados. Na verdade, muitas vezes é vantajoso usar vários marcadores de células imunes em combinação, para permitir a análise simultânea do movimento nuclear e a morfologia da célula (veja resultados representativos). No entanto, desde que este protocolo envolve o uso de pupas de Drosophila , apenas combinações de marcadores genéticos que são viáveis até meados-pupal estágios podem ser utilizados. Além disso, estoques letais embrionários não será apropriados. Isso é pouco provável que seja um problema quando o controle de imagem (ou tipo selvagem) pupas mas é importantes considerar quando os genes estão para ser derrubado ou overexpressed, para avaliar seus efeitos sobre o fechamento de ferida ou inflamação. No caso de letalidade precoce causada por gene nocaute (ou superexpressão), um Gal80^ts construção pode ser usada para induzir o nocaute Gal4-conduzido mais tarde no desenvolvimento (ver discussão).

Em estudos recentes, movendo-se para a fase de pupa nos permitiu coletar dados de trajetória de célula imune suficiente para analisar o comportamento inflamatório usando modelagem matemática sofisticada, que por sua vez nos permitiu deduzir novos detalhes da ferida attractant inflamatória sinaliza²³. Por exemplo, esta abordagem revelou que a ferida quimiotático espalha-se lentamente através do tecido inflamado em 200/min²μm, um ritmo muito mais lento do que o sugerido anteriormente moléculas pequenas candidato como o ATP ou H₂O₂ são relatados para difusa de²⁸^,de²⁷^,²⁶^,²⁹; Estas moléculas pequenas “danos” em vez disso são prováveis que atuam como sinais permissivos. Além disso, como eles resolver longe uma ferida inicial e estão expostos a um segundo (feito em vários momentos após a primeira), seguindo o comportamento a longo prazo das células do sistema imune inatos, nós descobrimos um período temporário ‘dessensibilização’ durante a quais as células imunes são cegos para lesões subsequentes²³. Explorando o potencial a longo prazo da imagem latente do modelo pupal, juntamente com rastreabilidade genética da Drosophila , um pode acompanhar o comportamento de populações de células imunes específicas (por exemplo, somente as células imunes, recrutadas para o local da ferida) no resposta aos insultos subsequentes, usando o photoconvertible fluoróforo³⁰ que pode ser expresso exclusivamente dentro a linhagem de células imunes²³.

Aqui descrevemos um protocolo para visualizar a dinâmica da reparação da ferida e a resposta inflamatória associada em alta resolução espácio-temporais usando vivos pupas de Drosophila . Nós fornecemos uma metodologia detalhada para cobrir as etapas necessárias para a preparação de pupas inicial (dissecção e montagem) e a subsequente mediada por laser ferindo e a imagem latente de lapso de tempo. Descrevemos também o uso de foto-conversível fluorophores para permitir a rotulagem de célula imune específica subconjuntos no vivo. A longo prazo, vislumbramos que este novo modelo pupal Drosophila vai abrir possibilidades excitantes para dissecar a complexa dinâmica de sinalização subjacentes a resposta inflamatória ao dano tecidual. Aplicando mais sofisticadas análises estatísticas um pode descobrir características de resposta que caso contrário permaneceria experimentalmente inacessíveis, enquanto a eficiência melhorada de RNAi poderia emprestar-se a aplicação de todo o genoma de rastreio dentro células do sistema imunológico na vivo para identificar novos jogadores que regulam o comportamento de células imunes.

Protocol

Este protocolo é composto por quatro principais etapas sequenciais: (1) preparação de estoques de Drosophila e encenação de pupas de Drosophila , (2) dissecação Pupal e montagem, ferindo Pupal (3), (4) na vivo imagiologia confocal lapso de tempo. 1. preparação de estoques de Drosophila e encenação de pupas Obter o apropriado estoques de Drosophila (ver Tabela de materiaise introdução). Recolha o jovens saudáveis moscas adultas do genótipo adequado. Selecione adulto voa usando almofadas de gás de dióxido de carbono para anestesiar brevemente as moscas e um pincel fino para transferir voa do genótipo apropriado ou gênero para um frasco de recolha. Adicionar 20 virgens fêmeas e 20 machos para cada frasco contendo mídia padrão alimentar voar (uma mistura de farinha de milho-melaço-agar, consulte Tabela de materiais) suplementado com fermento. Para a geração de pupa ideal, ponta do adulto voa diariamente sobre novos alimentos em frascos de frescos, mantendo todos os frascos a 25 ° C.Nota: Se o sistema de Gal4-UAS31 está sendo usada para dirigir a expressão gênica de linhagem específica, todas as etapas devem ser executadas a 25 ° C ou acima, como o sistema de Gal4-UAS é sensível à temperatura. 18 h antes da sessão de imagem programada, selecione pelo menos 10 recém-formado brancos pré-pupas (figura 1A) os frascos (ou seja, 0 h depois da formação do casulo, APF) usando fórceps ou um pincel fino para desalojar pupas da superfície interior do frasco e pupas de transferência com cuidado ao lado de um frasco de plástico limpo, vazio.Nota: Errante 3rd ínstar larvas rastejam para cima fora o meio comida submeter-se a pupa; recém-formado pré-pupa branca é facilmente identificadas como eles possuem sempre espiráculos anteriores e são estacionários (ao contrário de 3rd ínstar larvas). A cutícula transforma-se o ‘casulo’ (no caso de pupa) que é inicialmente suave e branca17. Deve ter cuidado para não danificar as pupas, pois isso pode levar não só a uma resposta inflamatória induzida por lesão indesejada, mas também para um atraso significativo no desenvolvimento. Idade as pupas selecionadas para a fase do desenvolvimento apropriada (18 h APF dará resultados optimal) no frasco a 25 ° C.Nota: Como as pupas desenvolvem-se, no caso de pupa se tornará progressivamente mais escura e mais frágeis. Prepare outros reagentes para a próxima etapa antes do tempo. Para fazer o heptano cola, combinar um comprimento de 20 cm de fita dupla-face enrolado com heptano 20 mL em um tubo de centrífuga de 50 mL, sele com a parafina cinema e do rock na temperatura durante a noite no banco. 2. preparação e dissecção das pupas de Drosophila Transferi as pupas de Drosophila encenadas para um pedaço de fita adesiva dupla-face, montado sobre uma lâmina de vidro. Posicione as pupas de modo que o lado ventral é firmemente preso à fita e o lado dorsal é virada para cima (figura 1B).Nota: O anterior da pupa será identificável dos dois espiráculos salientes da extremidade anterior do caso pupal. Retire cuidadosamente pupas de sua embalagem protetora casulo sob um microscópio de dissecação brightfield usando fórceps e microtesoura (figura 1B-D). Inicialmente, fazer uma incisão na região anterior-a maioria do casulo usando a pinça (figura 1B). Certifique-se de que o caso pupal nesta área é oco e desprovida de tecido pupal, porque as pupas vão ter encolhido dentro o caso durante o desenvolvimento precoce de pupa. Após esta incisão inicial, cuidadosamente rasgar ou abrir o caso pupal em um anterior para posterior direção usando fórceps ou micro-tesouras (Figura 1) até que a pupa é completamente grátis do invólucro frágil marrom opaco (Figura 1).Nota: Pupas nesta fase são muito frágeis e deve ter cuidado para evitar perfurar a superfície pupa; punção é óbvia como hemolinfa rapidamente vazamentos para fora do local da punção. Pupas com punções, porém pequenas, devem ser descartadas. Monte as pupas em um prato com fundo de vidro, usando cola de heptano. Use uma ponta de pipeta de 20 mL para colocar uma gota 10 mL de cola heptano pré-preparadas (consulte a secção 1.6 acima) em uma linha sobre o prato com fundo de vidro. Permitir que a cola secar por 5 s antes de transferir as pupas dissecadas cuidadosamente sobre a colagem de heptano usando fórceps (Figura 1E). Para facilidade de ferimento e de imagem, alinhe as pupas seguidas; aproximadamente 5 pupas são sugeridas, mas existirá mais gerenciável com experiência.Nota: O uso de cola de heptano é recomendado quando usando sistemas de imagem vertical mas não é necessário quando se utiliza um sistema invertido. Se a cola cria ótica aberrações durante pupas de imagem, podem ser colocadas diretamente sobre a lamela em vez disso – a adesão natural entre o tecido pupal e vidro será suficiente na maioria dos casos para tratamento de imagens estável, enquanto cuidado ao mover a imagem prato entre microscópios. Para melhores resultados, monte as pupas de modo que a asa é plana sobre a lamela com a maioria da superfície da asa, em contato direto com a lamela (Figura 1F). Role as pupas usando fórceps para mudar sua posição para garantir que a ala está montada corretamente. Para evitar a desidratação da amostra durante o período de geração de imagens, adicione um pedaço de papel de filtro absorvente embebido em água destilada para o lado do prato com fundo de vidro no final da montagem, tomando cuidado para não perturbar as pupas (Figura 1E). Cubra o prato com uma tampa.Nota: Pupas estão agora prontas para ferir e imagem. 3. induzida por laser ferindo de Drosophila asas Pupal Transferi o prato com fundo de vidro contendo as pupas montadas a um microscópio de campo amplo, equipado com um sistema de ablação do laser sintonizável. Uso de um laser pulsado-UV refrigerado a ar nitrogênio-bombeado ablação sintonizado com 435 nm – consulte Tabela de materiais para detalhes11; o comprimento de onda preciso da luz usado para a iluminação é selecionado pelo usuário através de uma célula de corante apropriado. Usando brightfield óptica, ajuste os controles de fase de microscópio para localizar a ala pupal da pupa primeiro ser ferido (Figura 1F). Para obter melhores resultados, use uma lente de objetiva de imersão 40 X ou 63 X óleo para ambas as imagens e laser ablação; Certifique-se de que o líquido de imersão usado (óleo ou glicerol) é consistente entre sistemas de imagem e ablação. Ajustar o microscópio para se concentrar no avião do epitélio pupal asa mais próximo a lamela de vidro (ou seja, o foco sobre a região do epitélio estar ferido) usando o botão de controle de foco fino. Usando os ajustes de fase de microscópio, posicione a pupa asa para que a área a ser ferido é alinhada diretamente com a área de alvo conhecido do laser ablação. Use um slide de atenuador de densidade de energia cabido para o microscópio para ajustar manualmente o nível de potência da luz ablação.Nota: O controle deslizante atenuador tem clique paradas e decisões para identificar o nível relativo de atenuação e permitir o uso de configurações pode ser reproduzidos. Usando um controle manual externa gatilho , ative o laser ablação usando um único clique breve do gatilho para fazer uma ferida. Lá pelo aparecimento da bolha de ar transitória no local da ablação desde ferindo normalmente será acompanhado. Verifique se o ferimento induzida por laser tem sido bem sucedido usando os filtros fluorescentes apropriados para visualizar o epitélio pupal.Nota: tenha cuidado para evitar a exposição acidental para os raios laser como as reflexões do feixe podem causar graves ou danos de pele. Se o ferimento não for bem sucedida, variar o plano focal (movendo o foco do microscópio ligeiramente acima ou abaixo do nível atual de focal) e repetir o único clique de gatilho a ablação. Alternativamente, gradualmente aumente a potência do laser usando o slide atenuador até o tamanho da ferida desejada seja alcançado. Para variar a taxa de repetição do pulso de laser ablação, utilize o botão de taxa de repetição do painel traseiro (que altera a taxa de pulso de menos de 1/s até 60 Hz). Para ferindo ideal, defina a taxa de repetição de pulso de 40 Hz. Para gerar feridas de tamanhos diferentes, use o slide de atenuador de densidade de energia para ajustar manualmente o nível de potência da luz ablação. Abster-se de todas as pupas montadas ferindo e usar estes pupas não retirado como controles intacta. Para resultados consistentes, realinhe regularmente o sistema de ablação (usando o manual de instruções relevante). Também, limpe e volte a encher a célula de ressonador de tintura que controla o comprimento de onda de saída do laser. 4. in Vivo imagiologia Confocal lapso de tempo Transfira rapidamente o prato com fundo de vidro para um microscópio apropriado para a imagem latente de lapso de tempo.Nota: Para obter melhores resultados, use uma alta especificação confocal ou microscópio de disco girando equipados com detectores sensíveis que podem detectar fluorophores tanto GFP e mCherry. Para a ala pupal de imagem, use uma lente objetiva de baixa ampliação (por exemplo, 20 X) (Figura 2A). Em ordem para a reparação de imagem ferida e a resposta inflamatória que acompanha com alta resolução espacial, use a imersão de óleo 40 X (at 1.3) ou 63 X lentes de objetivas (at 1.4) (ver imagens representativas na Figura 2B-D). Abra o software de captura de imagem apropriado associado com o microscópio. Usando o software de captura de imagem, ligue o laser adequado , por exemplo, a 488 nm e 561 lasers de nm para visualizar fluorophores GFP e mCherry, respectivamente (clicando nas caixas pertinentes) e ajustar a potência do laser e ganho/deslocamento configurações para dar suficiente sinal fluorescente, evitando a saturação do pixel; Use o poder do laser possível menor (na faixa 5-20%) para minimizar fotobranqueamento e fototoxicidade. Para capturar os dois a reparação epitélio e recrutamento de células inflamatórias, definir o microscópio para gravar uma z-pilha usando os botões de ajuste de foco fino no painel de controle; para obter melhores resultados, definir o software (usando cliques de botão manuais) para registro z-corta a asa pupal (mínimo de 3 mm cada), da parte superior do epitélio ferido através para o espaço extracelular abaixo (contendo migrando hemócitos) para alcançar um grande z-pilha (na faixa de 50-100 mm). Para a imagem latente de lapso de tempo, gravar z-pilhas em intervalos de tempo regulares (mínimo cada 30 s) pelo menos 1 h pós-ferindo.Nota: O intervalo de tempo exato entre z-pilhas escolhido representa um trade-off entre capturar a dinâmica celular rápida mutação e evitando foto-branqueamento das amostras. Para simultaneamente múltiplos pupas (incluindo controles intacta não retirado) de imagem, use um palco motorizado (anexada ao microscópio) e o recurso de multi-posição aquisição disponível dentro do software da imagem latente. Definir manualmente a posição de cada pupa individual dentro do software usando os botões de controle de posição de palco e defina manualmente os limites de z-pilha apropriada (superior e inferior) para cada individual crisálidas. Visualize as imagens de lapso de tempo durante a captura de imagem, ou mais tarde, com software de análise de imagem de especialista (como ImageJ32) usando projeções z-pilha ou renderização 3D. Por exemplo, para acompanhar os movimentos de hemócitos individuais (como na Figura 2′ e D’), faixa hematócito núcleos usando o acesso aberto ImageJ plug-ins “TrackMate” ou “Controle Manual” (métodos publicados em 33, 34). Usar sondas de photoconvertible (como Kaede30) para seletivamente photoconvert e rotular um subconjunto de células epiteliais ou imunes durante a imagem latente. Abrir os módulos apropriados dentro do software de imagem para executar o photoconversion (tais como o FRAP, recuperação de fluorescência após o clareamento foto módulo) e ativar a 405nm laser (clicando na caixa de software relevantes)35. Selecione as células para ser photoconverted dentro do software FRAP usando a ferramenta Seleção quadrada, circular ou freehand. Dentro do software FRAP, defina o tempo-curso para photoconversion (branqueamento) para um único iteração/quadro e 405 nm laser no poder do laser de 20%. Manualmente, clique em iniciar o experimento para executar photoconversion. Sair o módulo FRAP (clique perto) e retornar para a tela de imagem original dentro do software; uso o 488 nm e 561 lasers de nm para o comportamento de células photoconverted e não-photoconverted de imagem, definindo uma z-pilha e gravação de lapso de tempo, como acima.Nota: Photoconverted sondas permanecem estáveis por muitas horas após o photoconversion inicial, permitindo que o comportamento das células photoconverted para ser seguido ao longo do tempo (pelo menos 5 h). Por exemplo, células inflamatórias na ferida podem ser seletivamente photoconverted (Figura 2F) e seu comportamento seguido como eles determinação do local da lesão (Figura 2 e H).

Representative Results

Este protocolo descreve a preparação de pupas de drosófila para a imagem latente de lapso de tempo ao vivo do ferimento reparação e inflamação na vivo. Usando este método, é possível gerar vários filmes de alta resolução de fechamento da ferida pupal e recrutamento de células inflamatórias com facilidade e as pupas para longos períodos de tempo (pelo menos 5h) pós-ferindo sem fotobranqueamento significativo de imagem. Um esquema geral para a preparação de pupa de Drosophila A Figura 1 ilustra o método ideal para a preparação de pupas de drosófila para a imagem latente na vivo . Drosófila branca ‘pré-pupa’ é recolhidas em ‘0 h’ após a formação do casulo (APF), como as larvas rastejantes cessam motilidade e adotam a forma de pupa estereotipada com evertido apêndices respiratórios (espiráculos) visíveis na sua extremidade anterior-a maioria ( Figura 1A). O branco h 0 pré-pupa APF poderão desenvolver por 18 h a 25 ° C, altura em que tornou-se o casulo marrom (figura 1B) e são então dissecado usando pinça fina e/ou micro-tesouras (Figura 1, para remover a caixa protetora pupa) para revelar a opticamente translúcido pupa dentro (Figura 1). Após dissecação, as asas pupal será visíveis no lado lateral do tórax pupal (esboçado em azul, Figura 1-D). Nesta fase, outras partes do corpo pupal também são facilmente perceptíveis, incluindo os olhos, pernas e abdômen (rotulada na Figura 1). As pernas também são adequadas para estudos de inflamação da ferida e podem estar feridas, usando o mesmo método de laser descrito acima. Múltiplos de 18 h pupas APF podem ser montadas simultaneamente dentro do prato de imagem (Figura 1E, usando cola de heptano e um papel de filtro embebido de água para minimizar a desidratação) com a parte plana da asa (contorno azul) em contacto com a lamela ( Figura 1F); Isto é particularmente vantajoso se a imagem do microscópio é equipado com um palco motorizado para permitir que vários pupas ser gravado durante um único período de imagem. Quaisquer que tenham sido danificadas durante a montagem ou dissecação pupas devem ser descartadas (por exemplo, a pupa localizado a terceira na sequência, seta na Figura 1E). Outras partes do corpo (por exemplo, olhos e pernas, delineada rosa) também podem contatar a lamela e estão disponíveis para ferir e subsequente de imagem (Figura 1-F). Para experiências estudando único ferimentos, danos induzida por laser são geralmente melhor infligidos centralmente na ala (asterisco, Figura 1F), embora outros locais podem ser utilizados se múltiplas feridas estão a ser estudadas. Ferindo estéril ativa uma resposta inflamatória robusta na ala pupal drosófila Para seguir a reparação da ferida e o acompanhamento resposta inflamatória in vivo, as asas feridas de pupas APF Drosophila 18 h foram fotografada usando microscopia confocal de lapso de tempo (Fig. 2A-H). Nesta fase pupal, o epitélio da asa é simples folhas lisas de células (rotuladas aqui usando E-caderina GFP-etiquetado para marcar limites de célula individual, a margem de asa descritas na Figura 2A). Mesmo nas asas intacta (baixa ampliação, figuras 2A e 2A’), um grande número de células do sistema imunológico inatos migratórias (hemócitos, rotulados usando srp-Gal4 conduzido GFP citoplasmática, verde e nuclear RFP, magenta) encontram-se dentro a hemolinfa ( sangue de insetos) ocupando o espaço extracelular intermediárias (Figura 2A e 2A’). Lesão induzida por laser para o epitélio pupal asa (margem ferida delineado em branco, Figura 2B-D) estimula uma rápida migração de hemócitos ao local da ferida (Figura 2B-D e do núcleo de células imunes na Figura 2B ‘-D’). Rotulagem de hemócitos com ambos um nuclear marcador (por exemplo, o nuclear RFP ‘vermelho-ferrão’) em combinação com um marcador citoplasmático ou do citoesqueleto (por exemplo, GFP citoplasmática ou GFP-etiquetado Moesin) é particularmente vantajoso, pois permite a monitoramento simultâneo de hematócito núcleos (para análise automatizada de hematócito comportamento por exemplo, migração de velocidade e direção) e a visualização da morfologia hematócito. O último é importante, pois permite-nos determinar se hemócitos são fagocitose detritos necróticos (Figura 2, inset) na borda da ferida (ou micróbios no caso de infecção)12,23 e também nos permite seguir seu comportamento cêntrica como eles se estendem bem filopodia ou lamellipodia em sua ponta como elas migram em direção ou para longe da ferida. Simples de monitoramento de trajetórias nuclear hematócito, uso de software de análise de imagem apropriado32 (Tabela de materiais) demonstra a complexa dinâmica espaço-temporal da resposta inflamatória, semelhante ao relatado anteriormente para ferido embriões9,36 (faixas coloridas, Figura 2′ e D’). Dentro de apenas 30 min do ferimento, hemócitos localizados mais próximo ao local da lesão começam a migração dirigida em direção a ferida (Figura 2′). No entanto, com o aumento da pós-lesão tempo, hemócitos localizados progressivamente mais longe do local da lesão também começam migração dirigida para a ferida (Figura 2D’). Desta forma, uma ‘onda’ de capacidade de resposta imune celular que se espalha para fora da borda da ferida é observada, que montamos para refletir a difusão da ferida quimiotático longe do local da lesão. Estas dinâmicas espácio-temporais imune celular fornecido um ponto de partida útil para nosso estudo recente que empregavam sofisticada análise matemática (‘inferência Bayesiana’) de modelagem para inferir Propriedades romance do sinal attractant ferida (métodos de detalhadas Publicado em23). Por calibrar nossos modelos computacionais (que vinculada o ferida attractant gradiente ao viés hematócito) para caber as trajetórias imune observados na vivo , um poderia extrair características detalhadas da attractant a ferida de nossa trajetória hematócito dados (como a taxa de difusão do sinal, a fonte e a duração da produção de sinal)23. Além disso, pela expressão do fluoróforo photoconvertible Kaede dentro da linhagem de células imunes usando srp-Gal4 (verde, Figura 2E) também fomos capazes de seletivamente rotular uma subpopulação de hemócitos estes asa migratórias (tais como de condução os recrutaram para o local da ferida; E, antes de photoconversion induzida por UV e F, post-photoconversion). Então, seguimos o comportamento desses hemócitos ao longo do tempo (magenta, Figura 2-H) como eles resolver longe do local da ferida (setas, Figura 2 e H) e comparam como seu comportamento é diferente dos não-photoconverted células que não atingem o local da lesão. Nós usamos esta na vivo técnica de rotulagem para demonstrar que hemócitos recrutados para uma inicial ferida são insensíveis temporariamente para uma segunda ferida gerada 90 minutos mais tarde,23, embora esta técnica de rotulagem diferencial poderia também tem muitas outras aplicações perspicazes no futuro (ver discussão). Usando essa abordagem, também simultaneamente, seguimos a dinâmica espaço-temporal de reparação da ferida ou contraste está ‘ (Fig. 2B-D). Aqui ubiquitously expressa GFP-com a tag E-caderina rotula as junções adherens celular em todo o epitélio da asa e permite que as formas das células epiteliais individuais a serem seguidas ao longo do tempo. A borda da ferida é facilmente identificada como a junção entre as células epiteliais GFP-etiquetado intactas e detritos sem rótulo (linha branca tracejada, Figura 2B-D). Para a maioria das feridas, a ferida começa a re-epithelialize dentro de 1 h da lesão e os ferida borda avanços para dentro (Figura 2D); feridas deste tamanho vão sarar normalmente dentro de 2-3 h de lesão23. Fechamento da ferida em embriões e pupas é impulsionado por um cabo de actomyosin contrátil juntamente com ponta rica em actina filopodia23,37; Estas dinâmicas do citoesqueleto podem ser visualizadas diretamente durante o reparo de ferida usando apropriado na vivo repórteres, tais como a GFP-etiquetado Spaghetti squash (cadeia leve reguladora de miosina) ou de Moesin do emperramento do actínio GFP-etiquetado23. Para algumas feridas particularmente grandes, no entanto, o cabo de actomyosin e filopodia de vanguarda não persistem – estas feridas se tornar ‘crônicas’ e nunca completamente re-epithelialize23 , mesmo após períodos muito mais longos (superior a 24 h) in vivo imagem latente. Curiosamente, a resposta inflamatória associada com estas feridas não CICATRIZÁVEIS é marcadamente diferente da associada com feridas agudas normal23 , sugerindo que o comportamento anormal de células imunes pode ser um marcador prognóstico útil na clínica . No futuro, ainda mais na vivo análise de feridas crônicas, utilizando imagens de longo prazo (mais de 24 h) no modelo de pupa pode fornecer importante visão mecanicista sobre esta condição debilitante. Figura 1: Preparação de pupa drosófila para ferir e geração de imagens ao vivo. (A) drosófila pré-pupa branca recolhidas às 0h APF, com extremidade anterior indicado pelo evertido respirando apêndices (espiráculos). (B) depois de criar a pré-pupa APF branco 0 h para 18 h a 25 ° C, o casulo aparece marrom. Dissecação do caso pupal deve começar na região mais anterior (seta), indicado pelos espiráculos sempre como adequada a pupa é ausente desta região e a pinça fina e/ou micro-tesouras usadas para remover a caixa protetora de pupa (C). As asas pupal será visíveis no lado lateral do tórax pupal (contornos azuis). (D) caso Pupal completamente retirados 18 h crisálidas APF, aqui a pupa tem sido rolada 90º para mostrar o lado lateral, com a asa para ser fotografada delineadas em azul. (E-F) Pupas APF 18h cinco montagem na lamela de vidro dentro de imagem prato usando cola de heptano, com papel de filtro embebido de água para minimizar a desidratação (E). Pupa terceiro localizado na sequência (seta) deve ser descartado como dano ocorreu durante a preparação. Pupas são montadas com a parte plana da asa (contorno azul) em contacto com a lamela (F) e feridas induzida por laser são geradas centralmente na ala (asterisco, F), embora outros locais podem ser utilizados se forem múltiplos ferimentos a ser estudado. A imagem em (D) adaptada com permissão de tecelões et al, 201623. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Figura 2: Dinâmica na vivo análise da resposta inflamatória ao dano tecidual. Pupas dissecado de capas protetoras pupal e montado na lamela de vidro (A) estão feridas e posteriormente fotografaram usando microscopia confocal de lapso de tempo (B-H). Baixa visão de ampliação da ala pupal intacta (A, margem de asa em branco) que contém um grande número de hemócitos migratórios (A’). Lesão induzida por laser para o epitélio pupal asa (B-D, limites da célula rotulados usando GFP-etiquetado Drosophila E-caderina; ferida margem delineada em branco) ativa uma resposta inflamatória rápida com a migração de vários hemócitos ( SRP-Gal4 conduzido a expressão de RFP nuclear, GFP citoplasmática e magenta, verde) em direcção ao local da ferida (B-D; quadros representativos de um filme lapso de tempo em que cada quadro é uma projeção de 25 fatias 3 μm cada). Controle manual de trajetórias hematócito (faixas coloridas, C’ e D’) indicam a complexa dinâmica espaço-temporal da resposta inflamatória, semelhante ao relatado para embriões feridos. Hemócitos também fagocitam restos celulares necróticos no local da ferida (ponta de seta, C e também de encastrar). Expressão do fluoróforo photoconvertible Kaede na linhagem de células imunes (verde, E, usando o srp-Gal4) permite que a ferida-recrutados hemócitos (seta, E) ser diferencialmente rotulado (magenta, F) e seguido ao longo do tempo como eles determinação do local da lesão (setas, G e H). Foram utilizados os seguintes genótipos pupal: (A-D) w1118; ubi-DE-cad-GFP, srp-Gal4 > UAS-GFP(II); UAS-nRFP(III) e (E-H) w1118; srp-Gal4(II); UAS-Kaede(III). Imagens adaptadas com permissão de tecelões et al, 201623. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A resposta inflamatória aguda ao dano tecidual é um processo complexo e altamente dinâmico que é essencial para orquestrar a reparação dos tecidos feridos, incluindo o apuramento dos detritos necróticos e a luta contra a infecção. Para inteiramente compreender e desvendar os aspectos fundamentais desta resposta, é fundamental que estudos são realizados na vivo em amostras de 3-dimensional vivos em ordem para o comportamento exato e interações das várias linhagens envolvidas para ser seguido da pilha com precisão ao longo do tempo. Análise em tempo real destas dinâmicas de célula permite uma caracterização mais detalhada dos fenótipos mutantes do que estático único-pontos de tempo de amostras fixas usando técnicas de imuno-histoquímica clássico. Tradicionalmente, a maioria dos estudos de imagem ao vivo usando o modelo de Drosophila geneticamente tractable utilizaram fase embrionária de desenvolvimento fruitfly devido à sua translucidez óptico e imobilidade em comparação com os estádios de desenvolvimento mais tarde⁴ ^, ⁵. no entanto, mais recentemente o nosso grupo e outros desenvolveram a pupa drosófila como um novo modelo para executar a alta resolução e imagem a longo prazo de reparação da ferida e inflamação simultaneamente na vivo⁸^,²² ^,²³. Esta abordagem emergente oferece um excitante potencial a longo prazo para unraveling os aspectos fundamentais do comportamento celular inflamatória e pode ser ainda mais adaptada para investigar o comportamento dinâmico de outras linhagens de células (por exemplo, Drosophila adipócitos ³⁸) após a lesão tecidual.

Há um número de fatores críticos durante a preparação e imagem latente de pupas de Drosophila feridas que vai determinar a qualidade dos resultados de imagem descritos acima. Sem dúvida o passo mais difícil do protocolo descrito é a dissecção cuidadosa e posicionamento preciso das pupas antes da imagem e ferindo. Pupas nesta fase do desenvolvimento são extremamente frágeis e até mesmo pequenos danos acidentais para as pupas durante as fases de preparação prejudicará significativamente a experiência; qualquer pupas que podem ter danos não intencionais devem ser descartadas do experimento, desde que este dano pode ativar sua própria resposta inflamatória, que pode levar a mais difundida (ou mesmo sistêmicos) efeitos sobre o comportamento de células inflamatórias em outro lugar no a pupa. Devido ao desenvolvimento contínuo das pupas utilizados nesses experimentos (que estão passando por rearranjos de tecido significativa para preparar os tecidos para a idade adulta), ocasionalmente pupas moverá durante o curso da imagem latente. Rolling pupal é, no entanto, mais provável de ocorrer se pupas não foram montadas corretamente com a superfície plana da asa (ou de outro tecido para ser fotografada) em contato direto com a lamela; uso de cola de heptano para estabilizar as pupas no vidro tampa deve minimizar este movimento indesejável. Por este motivo, muito cuidado também deve ser tomado para evitar a desalojar as pupas de suas posições cuidadosamente alinhadas ao mover as amostras entre microscópios; Idealmente, o laser ferindo será anexado ao mesmo microscópio para ser usado para imagens de lapso de tempo subsequente e foto-conversão.

Além da proficiência da dissecação pupal e passos de montagem, o genótipo exato das pupas de Drosophila usado terá um efeito significativo sobre a qualidade dos dados gerados. Por exemplo, o número de cópias do driver Gal4 e construções UAS (por exemplo, UAS-GFP ou UAS-Kaede) dentro de um genótipo individual pupal determinará a relação sinal-ruído durante a imagem latente subsequente. Como regra geral, as mais cópias de um Gal4 ou UAS constroem presente, maior o nível total de proteína fluorescente (por exemplo, GFP ou Kaede) dentro do tecido. O nível ideal de proteína fluorescente, no entanto, será um equilíbrio cuidadoso entre elevação da fluorescência de tecido suficiente para permitir que a alta qualidade de imagem (permitindo o uso de baixas potências do laser, redução fotobranqueamento e imagem ao longo do tempo estendido períodos), mas sem causar toxicidade celular induzida por fluoróforo; o número ideal de Gal4 e UAS construções em cada experimento irá variar de acordo com os motoristas particulares e fluorophores sendo usado. Tenha cuidado para elevar as pupas a 25 ° C (ou acima, até 29 ° C), porque o sistema de Gal4-UAS é sensível à temperatura e será ineficaz em baixa temperaturas³¹. Para alcançar níveis adicionais de controle sobre o tecido ou tempo-especificidade de Gal4 –conduzido a expressão, o repressor do sistema Gal4-UAS Gal80 também pode ser incluído dentro o genótipo pupal³⁹. Gal80 também pode ser usado para reprimir a atividade de Gal4 dentro de um determinado tecido (usando um Gal80 de tecido-específica) ou em um determinado momento (usando uma temperatura sensível Gal80). O sistema de Gal4-UAS pode ainda ser combinado com outros sistemas binários independentes (tais como os sistemas de QF –QUAS e LexA –lexAop ) para gerar a drosófila , que tem várias construções (por exemplo, fluorophores, linhas de RNAi ou outras construções genéticas) expressa simultaneamente em uma variedade de diferentes tecidos³⁹.

Uso desse novo modelo pupal Drosophila oferece uma série de vantagens sobre a abordagem mais tradicional do embrião. Em comparação com a imagem de curto prazo (até 3 h) disponível em embriões de estágio 15 (a fase em que mais embrionárias ferindo estudos são executadas), pupas podem ser imaginadas durante significativamente mais longos períodos de tempo (em princípio, até a idade adulta após 96 h de desenvolvimento pupal ). Além disso, um número muito maior de hemócitos (células do sistema imunológico inatosDrosophila ) está presentes dentro de tecidos pupal (e disponível para a imagem latente) em relação ao número mais limitado presente dentro do embrião e isto permitiu-nos recolher significativamente mais dados sobre o comportamento do hematócito usando o mesmo número total de espécimes. Fundamentalmente, este, por sua vez, permitiu-nos aplicar mais sofisticada modelagem matemática para analisar o comportamento de hemócitos e extrair características inovadoras da ferida atrativos e resposta inflamatória que seria caso contrário permaneceram experimentalmente inacessível,²³. Outra vantagem do modelo pupal é que aquele knockdown RNAi-mediada do gene é consideravelmente mais eficiente do que no anteriores estágios embrionários, permitindo análise melhorada de tecido ou inativação de genes específicos de tempo usando sistemas binários, tais como o sistema de Gal4-UAS ³⁹. a eficiência de RNAi, nesta fase, portanto, abre-se o potencial para realizar em larga escala (ou até mesmo imparcial todo o genoma) telas de RNAi para procurar novos jogadores envolvidos no reparo de ferida ou comportamento de células inflamatórias.

No entanto, Drosophila pupas claramente não podem ser usadas para estudar os fenótipos resultantes de mutações genéticas que são embrionárias letal; estudos funcionais e geração de imagens ao vivo de genes que são essenciais para o desenvolvimento embrionário, portanto, ainda devem ser realizados em embriões, a menos que o knockdown RNAi-mediada do gene em um tempo ou forma tecido-específica permite desenvolvimento ocorra através de estágios pupal. O embrião também continua a ser o modelo de escolha para estudar e viver-imagem certas características do comportamento de células imunes, incluindo a dispersão do desenvolvimento das células do sistema imunológico de sua origem, contato-inibição de locomoção e fagocitose de corpos apoptotic gerados durante o desenvolvimento tecido escultura⁵^,⁸ , que ainda não foram observadas em modelos pupal. Embora estudos em Drosophila larvas e adultos forneceram uma visão importante sobre os mecanismos subjacentes a ferida reparo e inflamação⁴⁰^,⁴¹^,⁴²^,⁴³^, estudos de imagem ao vivo ⁴⁴ estas fases têm provado difícil devido à natureza inerentemente móvel das amostras. Enquanto as larvas podem ser anestesiadas para permitir breves períodos de geração de imagens ao vivo, devido à natureza temporária da anestesia, só curtos instantâneos da ferida ao vivo reparar ou resposta inflamatória pode ser visualizado⁴⁵. Um estudo recente desenvolveu um protocolo melhorado que permite imagens de longo prazo de larval ferida cura⁴⁶, apesar de preparação e imagem ainda permanecem consideravelmente mais desafiador do que em embriões ou pupas. A longo prazo, nós encaramos isso utilizando a fase de desenvolvimento mais adequado para resolver cada questão específica, estudos em todos os quatro destes estágios diferentes de Drosophila – de embriões através de períodos larvas e pupal, à idade adulta (cada um com suas próprias vantagens exclusivas e limitações) – irá fornecer insights complementares sobre o mecanismo molecular e celular, dirigindo a reparação da ferida e inflamação.

No futuro, este protocolo para a imagem a longo prazo da drosófila pupas e ferindo pode ser facilmente adaptado para estudar uma variedade de fenômenos relacionados com inflamação e tem um potencial de longo alcance para descobrir características inovadoras da resposta inflamatória ferida. A combinação da imagem a longo prazo, juntamente com o pedido de photoconvertible fluorophores (tais como Kaede), são de grande valia para a compreensão da dinâmica do comportamento celular imune inata e em particular, o mais distante menos entendido fase de resolução de a resposta inflamatória da ferida. Etiquetando especificamente qualquer indivíduo ou subpopulações de células do sistema imunológico (tais como aqueles recrutados para uma ferida) será possível analisar como a exposição a uma sinalização ambiental (como um cadáver ou lesão) afeta a resposta subsequente da célula imune a uma posterior sugestão. O comportamento inflamatório de hemócitos de Drosophila pode ser alterado por experiências anteriores – por exemplo, eles são pré-pintados para responder à lesão tecidual por fagocitose prévia dos corpos apoptotic durante desenvolvimento¹² , mas ela continua a ser visto se outras pistas ambientais induzem eventos similares de escorva. Embora estudos de pupa feridas até agora têm-se centrado sobre a resposta inflamatória inata, o modelo de asa pupal também oferece uma oportunidade ideal para ambos viver-imagem e dissecar os mecanismos subjacentes a reparação epitelial ferida. Além disso, este método de imagem pupal também poderia ser adaptado para investigar o comportamento dinâmico de outras linhagens de células em resposta ao tecido danos³⁸, na ala pupal propriamente dito ou outros tecidos pupal facilmente acessíveis (por exemplo, olhos, pernas e tórax). Finalmente, combinando a rastreabilidade genética da Drosophila juntamente com a facilidade de imagiologia pupal a longo prazo, romance reparação epitelial ou reguladores inflamatórios podem ser descobertos através da aplicação de imparcial todo o genoma knock-down aproxima-se.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer aos membros do Martin, Nobes, Richardson e laboratórios de madeira para discussão útil. Agradecemos também a facilidade de Bioimaging Wolfson (Universidade de Bristol, UK), o centro de estoque de Bloomington (Universidade de Indiana, EUA) e Viena Drosophila Resource Centre (para estoques de Drosophila ) e Flybase (para até à data da drosófila anotação de gene). Este trabalho foi apoiado por uma concessão do projeto MRC-horas e W.W. (Sr/J002577/1), um Wellcome Trust Senior Fellowship para W.W. e um Wellcome Trust Investigator Award-horas.

Materials

*Drosophila* stocks
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII)	Kyoto Stock Center, DGRC	#109007	Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;;Ubi-p63E-shg.GFP (III)	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#58742	Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP.
ubiquitous GFP-tagged Moesin P{sGMCA}3.1	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#59023	The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T.
hemocyte specific serpent-Gal4 driver ;srp-Gal4;	Generated by Katja Bruckner	Generated by Katja Bruckner	Expression of ScerGAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004).
UAS-nuclearRFP w1118;;P{UAS-RedStinger}6	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#8545 or #8547	UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal
UAS-cytoplasmicGFP ;;P{UAS-GFP.S65T}	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	Multiple stocks available (e.g. #1522)	Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness.
UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#26161	Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV.
GFP-tagged spaghetti squash w1118;;P{sqh-GFP.RLC}	Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University)	#57145	The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:AvicGFP^S65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter.
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
Ingredients for fly food media			Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.)
maize	Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)	Contact supplier direct	organic
soya flour	Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)	Contact supplier direct	organic
malt extract	Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)	Contact supplier direct	organic
molasses	Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier)	Contact supplier direct	organic
Difco agar	BD Biosciences, Fisher Scientific	DF0142-15-2	For preparation of fly food
Propionic acid	Sigma	402907	For preparation of fly food
Nipagen	Sigma	79721	For preparation of fly food
Dried baker's yeast	Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD	Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD	For preparation of fly food
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
Sample preparation and mounting
Parafilm	Sigma	P7793-1EA	For preparation of heptane glue
Fine sable paintbrush	Daler-Rowney (or equivalent)	#0 or 1
Forceps	Fisher Scientific (or Fine Science Tools)	NC9404145	Dumont #5
Glass bottomed dishes for imaging	MatTek	P35G-0-10-C	We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment.
Heptane	Sigma	51730-5ML	For preparation of heptane glue
Double sided sticky tape (e.g. Scotch)	Agar Scientific	AGG263	For preparation of heptane glue
50ml tube (for heptane glue)	Falcon tubes from Fisher Scientific	14-432-22	For preparation of heptane glue
Glass microscope slides	Agar Scientific	AGL4244	For dissection of Drosophila pupae
Dissecting stereo microscope with brightfield	Leica (or equivalent)	M50	For dissection of Drosophila pupae
Microscissors	John Weiss International	103123	Miniature Research Scissors (straight)
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
Laser ablation and imaging
Nitogen ablation laser	Spectra-Physics (or Andor equivalent)	Model VSL-337ND-S	For wounding, this should be attached to a widefield imaging system
Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM)	Leica (or equivalent)	TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent)	Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal)
Environmental chamber	Life Imaging Services (or equivalent)	"Microscope Temperature Control System"	Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging
Name	Company	Catalog Number	Yorumlar
Image Analysis Software
FRAP software module	Leica (or equivalent)	CLSM FRAP software module	For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede
ImageJ (image analysis software)	National Institutes of Health (NIH)	https://imagej.nih.gov/ij/	Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012.
ImageJ plugin "Manual Tracking"	National Institutes of Health (NIH)	https://imagej.net/Manual_Tracking
ImageJ plugin "TrackMate"	ImageJ, NIH	https://imagej.net/TrackMate	Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081
Volocity (high performance 3D imaging software)	Perkin Elmer	Volocity 6.3	For image analysis
IMARIS (image analysis software)	Bitplane	IMARIS for Cell Biologists	For image analysis

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In Vivo Tracking Inflammatory Cell Dynamics Drosophila Pupae Live Imaging Wound Healing Innate Immunity RNAi Gene Inactivation Pupal Stage Hemocyte Pupae Collection Pupal Casing Dissection Mounting Heptane Glue

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Weavers, H., Franz, A., Wood, W., Martin, P. Long-term In Vivo Tracking of Inflammatory Cell Dynamics Within Drosophila Pupae. J. Vis. Exp. (136), e57871, doi:10.3791/57871 (2018).