在这里, 我们提出了一个实时成像伤口修复的协议和相关的炎症反应在高时空分辨率的体内。该方法利用果蝇发育的蛹阶段, 实现对特定细胞种群的长期成像和跟踪, 并与有效的 rna 干扰介导的基因失活相兼容。
在对组织损伤的快速炎症反应中, 先天免疫系统细胞迅速被招募到受伤部位。一旦在伤口上, 先天免疫细胞就会执行一些基本功能, 如抗感染、清除坏死碎片和刺激基质沉积。为了充分理解调节这种免疫应答的各种信号事件, 重要的是观察在体内的多细胞谱系 (和相互作用之间发生) 的复杂行为, 并在实时, 与高时空分辨率。果蝇胚胎的光学半透明性和遗传驯良已经建立果蝇作为一种无价的模式来生存图像和解剖炎症细胞行为的基本方面, 包括机制发展扩散, 清除凋亡的尸体和/或微生物病原体, 并招募伤口。然而, 最近的研究表明, 在果蝇生命周期 (果蝇蛹) 中使用更晚的阶段提供了许多明显的优势, 包括改进的 rna 干扰效率、更长的成像周期和显著增强的免疫细胞数。在这里, 我们描述了一个成像伤口修复的协议和相关的炎症反应, 在高时空分辨率的活果蝇蛹。为了遵循重新上皮和炎症的动态, 我们使用了一些特定的活体荧光标记物, 用于上皮和先天免疫细胞。我们还展示了可转换显影的有效性, 如枫, 用于跟踪特定的免疫细胞子集, 追踪他们迁移到受伤部位的行为, 并从中解决。
有效和有效的炎症反应是任何有机体对抗感染, 清除碎片, 并安排修复受伤组织1的关键。虽然这种反应是大多数组织损伤的必然结果, 炎症需要严格的调节, 因为不适当的炎症反应已与各种不同的人类疾病 (包括慢性非愈合伤口) 联系在一起,疤痕过多, 易患癌症)1,2,3。鉴于这一临床相关性, 重要的是要获得一个更详细的了解的分子和细胞机制驱动炎症反应, 以制定新的预后指标和策略, 以治疗一系列慢性炎症条件, 这可能会保护修复组织免受长期和不必要的炎症。
近年来,果蝇已成为一个建立良好和有价值的模型系统, 以解剖的基本特征的炎症反应保存从昆虫到人类4,5。目前,果蝇提供了比目前在其他实验模型 (如小鼠或斑马鱼) 更大的遗传驯良, 允许在体内精确的时空遗传操作 (以灭活或在指定的发育时间点内, 在特定细胞类型中表达感兴趣的任何基因, 并能轻松地对全基因组屏幕6,7。传统上, 大多数活体影像学研究果蝇的伤口愈合和炎症是在胚胎阶段进行的, 因为胚胎是静止的 (不像果蝇幼虫或成人) 和光学半透明, 使无与伦比的高分辨率在体内成像8。这使得研究人员能够想象迅速而有力地招募果蝇先天免疫细胞 (包囊) 到伤口部位, 以应对机械或激光致胚胎上皮细胞损伤9,10,11,12,13,14. 通过将这些活体成像研究与基因操作结合起来,果蝇胚胎的研究发现了许多重要的免疫细胞蛋白, 可以控制体内的炎症细胞行为。例如, CED-1 同源德雷柏 (一种 ITAM 域含蛋白) 被确定为一种重要的 ‘ 损伤受体 ‘, 它以 H2O2依赖的方式将招募果蝇免疫细胞介导到伤害15。在免疫细胞内的德雷柏水平依次由钙诱导的 JNK 信号和凋亡尸体摄取的下游升高12。全血细胞运动还需要复杂的骨架改变, 以协调定向移向伤口, 这取决于骨架监管机构的活动, 如肌动蛋白捆绑的蛋白质 Fascin16 , 和一家小GTPases Rac 和9。
果蝇是一种 holometabolous 昆虫, 经过胚胎发育后的额外幼虫和蛹阶段, 在达到成年17之前。果蝇蛹已被开发成一个额外的模型, 为非侵入性活成像的各种动态细胞事件, 包括发育细胞迁移18, 细胞分裂19, 细胞生长20, 和肌肉收缩21。最近, 它已经建立了一个新的模型, 以研究创伤修复和炎症在体内22,23的动态。
正如在胚胎阶段,果蝇蛹是静止和光学半透明的, 经过仔细解剖, 从他们的不透明蛹病例18。通过利用这种光学透明性, 你可以遵循先天免疫细胞 (包囊) 的体内行为, 以应对果蝇蛹组织中的组织损伤, 如蛹翼22。蛹翼存在于一个简单的双层结构, 由两个大的扁平上皮片组成, 在机翼周围连接;这两个上皮层之间的细胞外空间充满血淋巴 (昆虫血) 和大量的运动包囊24。就像在胚胎中, 机械或激光导致的机翼上皮损伤触发迅速招募包囊到受伤地点23。然而, 这个蛹阶段提供了一些明显的优势, 在早期的胚胎阶段的成像。受伤的蛹可以成像在较长的时间段 (至少5小时), 更多的组织面积可用于实验性摄动 (如多发伤的产生), 并有大量的包囊目前在这个阶段 (在数学分析中提供更多的距离来提高统计能力的细胞轨迹)。此外, rna 介导的基因失活的效率在蛹阶段有很大的改善, 使得许多基因在组织中被 “击倒”, 或者与较传统的胚胎整体突变方法相比更具时间特异性。
为了遵循这个新的蛹模型中的伤口再上皮和伴随的炎症反应的动力学, 必须标记两个不同的细胞群体: 蛹上皮和先天免疫细胞 (果蝇包囊)。有许多不同的标记 (材料表) 可以标记这两种不同的细胞群–标记的选择取决于要研究的特定过程。为了标记蛹上皮, 含有无所不在表达的 GFP 标记的 e-钙黏蛋白 (标签 adherens 连接) 的果蝇线通常用来表示细胞边缘的位置, 或者是 gfp 标记的肌动蛋白结合领域的膜突 (标签肌动蛋白细胞骨架), 以可视化的伤口边缘收缩肌动蛋白环和前沿突起。为了标记果蝇包囊, 全血细胞特定的srp-Gal425驱动核 RFP 的表达 (用于核追踪), 细胞质 gfp 或 gfp 标记膜突 (分别标记细胞质或肌动蛋白细胞骨架) 或使用 photoconvertible 荧光 (如枫)。事实上, 在组合中使用多个免疫细胞标记通常是有利的, 从而能够同时分析核运动和细胞形态 (见有代表性的结果)。然而, 由于这项议定书涉及果蝇蛹的使用, 只有遗传标记的组合是可行的, 直到中蛹阶段可以利用。而且, 胚胎致命的股票也不合适。这不太可能是一个问题时, 成像控制 (或野生型) 蛹, 但重要的是要考虑当基因被击倒或抗原, 以评估其对伤口闭合或炎症的影响。在基因击倒 (或过度表达) 导致的早期致死性的情况下, Gal80ts构造可以用来诱导 Gal4-driven 在以后的发展中被击倒 (参见讨论)。
在我们最近的研究中, 进入蛹阶段使我们能够收集足够的免疫细胞弹道数据, 用复杂的数学建模来分析炎症行为, 这反过来又让我们推断出了伤口的新细节。炎症引诱剂信号23。例如, 这种方法表明, 伤口趋化因子在发炎组织中缓慢传播200微米2/分钟, 比先前建议的小候选分子如 ATP 或 H2O2的速度要慢得多, 报告漫射26,27,28,29;这些小的 “损伤” 分子反而很可能充当宽松信号。此外, 通过遵循先天免疫细胞的长期行为, 因为他们解决从最初的伤口, 并暴露在第二 (在不同的 timepoints 后, 第一次), 我们发现了一个暂时的 ‘ 脱敏 ‘ 期间, 其中免疫细胞对随后的伤害视而不见23。利用蛹模型的长期成像潜能, 连同果蝇的遗传驯良, 你可以遵循特定的免疫细胞群体的行为 (如只有那些被招募到伤口部位的免疫细胞) 在对随后的侮辱的反应, 使用 photoconvertible 荧光30 , 可以完全表达在免疫细胞谱系23。
在这里, 我们描述了一个协议, 以可视化的创伤修复的动态和相关的炎症反应在高时空分辨率使用活果蝇蛹。我们提供了一个详细的方法, 以涵盖最初的蛹准备 (解剖和安装) 和随后的激光介导伤人和时间推移成像所需的步骤。我们还描述了使用可转换显影, 以允许在体内标记特定的免疫细胞子集。从长远来看, 我们设想这个新的果蝇蛹模型将打开令人兴奋的可能性, 以解剖复杂的信号动力学的基础上炎症反应组织损伤。通过应用更复杂的统计分析, 你可能发现反应的特点, 否则将保持实验性无法访问, 而改进的 rna 干扰效率可以在应用全基因组筛选免疫细胞在体内识别新的玩家调节免疫细胞的行为。
急性炎症反应的组织损伤是一个复杂和高度动态的过程, 这是必不可少的, 以协调修复受伤的组织, 包括清除坏死碎片和打击感染。为了充分理解和解开这一反应的基本方面, 重要的是在体内对3维活体样本进行研究, 以使所涉及的各种细胞血统的精确行为和相互作用准确地随着时间的推移。对这些细胞动力学进行实时分析, 可以用经典的免疫组化技术, 比固定样本的静态单时间点更详细地描述突变体表型。传统上, 大多数使用基因处理果蝇模型的活体成像研究都使用了果蝇发育的胚胎阶段, 因为它的光学半透明性和不动性与后期发育阶段相比4 。,5. 然而, 最近, 我们的小组和其他人已经开发了果蝇蛹作为一种新的模式, 以执行高分辨率和长期的创伤修复和炎症的慢性影像在体内8,22 ,23。这种新兴的方法为解开炎症细胞行为的基本方面提供了令人振奋的长期潜力, 可以进一步适应研究其他细胞血统的动态行为 (如果蝇脂肪体38) 组织损伤后。
有许多关键因素在准备和成像受伤的果蝇蛹, 这将决定质量的成像结果所述。可以说, 最困难的步骤是描述的协议是仔细解剖和精确定位的蛹之前, 伤和成像。蛹在这个发育阶段是极其脆弱的, 甚至小的意外伤害的蛹在准备阶段将显著损害实验;任何可能持续性损伤的蛹都必须从实验中丢弃, 因为这种损伤可能激活其自身的炎症反应, 这可能会导致对其他地方的炎症细胞行为产生更广泛的 (甚至系统性的) 影响。蛹。由于在这些实验中使用的蛹的持续发展 (正在进行大量的组织重排以准备成年的组织), 偶尔蛹会在成像过程中移动。然而, 如果蛹没有正确安装在与 coverglass 直接接触的机翼 (或其他组织的平坦表面) 上, 蛹的滚动就更有可能发生;使用庚烷胶稳定盖玻璃上的蛹, 应尽量减少这种不良的运动。因此, 在显微镜之间移动样品时, 也必须非常小心避免逐出的蛹从它们精心排列的位置上移出;理想情况下, 伤激光将被连接到同一显微镜, 用于随后的时间推移成像和照片转换。
除了蛹解剖和安装步骤的熟练程度, 使用的果蝇蛹的确切基因型将对所产生的成像数据的质量产生重大影响。例如, 在一个单独的蛹基因型中, Gal4驱动程序和无人驾驶的结构 (例如, 枫) 的拷贝数量将在随后的成像过程中确定信噪比。通常情况下, Gal4或无人管的结构的拷贝越多, 组织内荧光蛋白 (如GFP 或枫) 的总水平就越大。然而, 荧光蛋白的最佳水平将是一个谨慎的平衡, 以提高组织荧光足以使高质量的成像 (使使用较低的激光功率, 减少漂白和成像延长时间期), 但不引起荧光诱导的细胞毒性;在每个实验中, Gal4 和无人参与结构的最佳数目将根据特定的驱动程序和显影的不同而有所不同。应注意提高蛹在25°c (或以上, 高达29°c), 因为 Gal4-UAS 系统是温度敏感的, 将无效的低温31。为了达到对Gal4驱动表达的组织或时间特异性的额外控制水平, Gal4-UAS 系统阻遏 Gal80 也可以包括在蛹基因型39中。Gal80 可以用来抑制特定组织内的 Gal4 活动 (使用组织特定的 Gal80) 或在特定时间 (使用温度敏感 Gal80)。Gal4-UAS 系统可以与其他独立的二进制系统 (如莱克萨lexAop和QUAS系统) 进一步结合, 生成具有多个构造的果蝇(如显影、rna 干扰线或其他基因构造) 同时表达在不同组织的范围内39。
使用这种新的果蝇蛹模型提供了一些优势优于传统的胚胎方法。与15期胚胎 (大多数胚胎损伤研究的阶段) 相比, 短期成像 (最多3小时), 蛹可以在很长一段时间内被成像 (主要是在蛹发育96小时后的成年后)。).此外, 包囊 (果蝇先天免疫细胞) 在蛹组织 (和可用于影像学) 中存在的数量远多于胚胎中存在的数量有限, 这使我们能够聚集更多使用相同的样本总数对全血细胞行为的成像数据。关键的是, 这反过来, 使我们能够应用更复杂的数学建模来分析包囊行为, 并提取伤口引诱和炎症反应的新特征, 否则将保持实验性无法访问23。蛹模型的另一个优点是, rna 介导的基因击倒比早期胚胎阶段效率要高得多, 允许用 Gal4-UAS 系统等二进制系统改进组织或特定时间基因失活的分析。39. 在这一阶段, rna 干扰的效率使我们有可能执行大规模的 (甚至是无偏见的全基因组) rna 干扰屏幕, 以寻找参与创伤修复或炎症细胞行为的新玩家。
然而,果蝇蛹显然不能用来研究由胚胎致死的基因突变造成的表型;因此, 对于胚胎发育至关重要的基因的功能性和活体成像研究, 必须在胚胎中进行, 除非 rna 介导的基因在时间或组织特定的方式下被击倒, 允许发展发生到蛹阶段。胚胎也仍然是研究和活图像的选择模型的免疫细胞行为的某些特征, 包括免疫细胞从其来源的发展扩散, 运动接触抑制和凋亡尸体吞噬在发育组织雕刻5,8尚未观察到的蛹模型中产生。虽然研究果蝇幼虫和成人提供了一个重要的洞察机制的基础伤口修复和炎症40,41,42,43,由于样本的固有流动性质, 在这些阶段进行的44种活体成像研究已被证明是困难的。虽然幼虫可以被麻醉, 允许短暂的活体成像, 由于麻醉的暂时性质, 只有短快照的活伤口修复或炎症反应可以可视化45。最近的一项研究已经制定了一个改进的协议, 允许长期成像的幼虫伤口愈合46, 虽然准备和成像仍然比在胚胎或蛹更具挑战性。从长远来看, 我们设想通过利用最适当的发展阶段来解决每个具体问题, 在所有四种不同的果蝇阶段进行研究-从胚胎到幼虫和蛹期到成年 (每个都有他们自己独特的优势和局限性)-将提供互补的洞察力的分子和细胞机制驱动伤口修复和炎症。
今后, 本议定书的创伤和长期成像果蝇蛹可以很容易地适应研究一系列的炎症相关的现象, 并具有深远的潜力, 以揭示新的特点炎症创面反应。长期成像的结合, 连同 photoconvertible 显影 (如枫) 的应用, 对于了解先天免疫细胞行为的动态具有重要的价值, 尤其是对伤口炎症反应。通过具体标记免疫细胞的个体或亚群 (如被招募到伤口的人), 就可以分析暴露在一个环境线索 (如尸体或伤害) 对免疫细胞随后的反应的影响。提示。果蝇包囊的炎症行为可以通过以往的经验来改变, 例如, 它们是在发育12期间对凋亡尸体的早期吞噬作用作出反应的, 但仍有待观察其他环境线索是否引发类似的启动事件。尽管迄今为止对蛹伤口的研究集中在先天炎症反应上, 蛹机翼模型也为活体图像和解剖上皮伤口修复机制提供了理想的机会。此外, 这种蛹成像方法也可以适应研究其他细胞谱系的动态行为, 以应对组织损伤38, 无论是在蛹机翼本身或其他容易接近的蛹组织 (如眼睛, 腿或胸部)。最后, 通过结合果蝇的遗传驯良和长期蛹成像的方便性, 新的上皮修复或炎症调节器可以通过应用无偏见的全基因组的击倒来发现方法。
The authors have nothing to disclose.
我们要感谢马丁、Nobes、理查森和伍德实验室的成员进行有益的讨论。我们还感谢沃尔夫森 Bioimaging 设施 (英国布里斯托尔大学), 布卢明顿证券中心 (印第安纳大学, 美国) 和维也纳果蝇资源中心 (果蝇种群) 和 Flybase (最新果蝇基因注释)。这项工作得到了一项由湄公河和水 (MR/J002577/1) 的项目补助金, 一个水的威康信托高级研究员和一个威康信托调查员奖给下午。
Drosophila stocks | |||
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;Ubi-p63E-shg.GFP; (chrII) |
Kyoto Stock Center, DGRC | #109007 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
ubiquitous GFP-tagged E-cadherin ;;Ubi-p63E-shg.GFP (III) |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #58742 | Ubi-p63E promoter sequences drive expression of Drosophila E-cadherin (shotgun) tagged at the C-terminal end with GFP. |
ubiquitous GFP-tagged Moesin P{sGMCA}3.1 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #59023 | The ubiquitously expressed sqh promoter/enhancer drives expression of a fragment of Moesin (that includes the actin binding sequences) tagged with GFPS65T. |
hemocyte specific serpent-Gal4 driver ;srp-Gal4; |
Generated by Katja Bruckner | Generated by Katja Bruckner | Expression of ScerGAL4 fused to a polyA tail is under the control of 2 genomic sequences from upstream of Drosophila serpent. Ref: Brückner, K., Kockel, L., Duchek, P., Luque, C.M., Rørth, P., Perrimon, N. The PDGF/VEGF receptor controls blood cell survival in Drosophila. Dev Cell. 7 (1), 73–84, doi: 10.1016/j.devcel.2004.06.007 (2004). |
UAS-nuclearRFP w1118;;P{UAS-RedStinger}6 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #8545 or #8547 | UAS regulatory sequences drive expression of the DsRed.T4 form of RFP which is tagged at the C-terminal end with a nuclear localisation signal |
UAS-cytoplasmicGFP ;;P{UAS-GFP.S65T} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | Multiple stocks available (e.g. #1522) | Expression of the S65T version of GFP by UAS regulatory sequences; the S65T variant exhibits increased brightness. |
UAS-photoconvertibleKaede w1118;; P{UAS-Kaede.A}3 |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #26161 | Kaede protein emits bright green fluorescence after synthesis, but changes efficiently to a bright stable red fluorescence on irradiation with UV. |
GFP-tagged spaghetti squash w1118;;P{sqh-GFP.RLC} |
Bloomington Drosophila Stock Centre (Indiana University) | #57145 | The sqh coding region, which is tagged at the C-terminal end with a T:AvicGFPS65T tag, is expressed under the control of the natural sqh promoter. |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Ingredients for fly food media | Fly food media is made according to standard procedures (see Greenspan, R. 1997. Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics. Cold Spring Harbor Press. 1-191 pp.) | ||
maize | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
soya flour | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
malt extract | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
molasses | Wild Oats, Bristol, UK (or equivalent supplier) | Contact supplier direct | organic |
Difco agar | BD Biosciences, Fisher Scientific | DF0142-15-2 | For preparation of fly food |
Propionic acid | Sigma | 402907 | For preparation of fly food |
Nipagen | Sigma | 79721 | For preparation of fly food |
Dried baker's yeast | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | Redstar, Dutscher Scientific, UK LTD | For preparation of fly food |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Sample preparation and mounting | |||
Parafilm | Sigma | P7793-1EA | For preparation of heptane glue |
Fine sable paintbrush | Daler-Rowney (or equivalent) | #0 or 1 | |
Forceps | Fisher Scientific (or Fine Science Tools) | NC9404145 | Dumont #5 |
Glass bottomed dishes for imaging | MatTek | P35G-0-10-C | We suggest using 35mm petri dishes, with at least a 10mm Microwell, 0.085-0.13mm cover glass, uncoated. Dishes with larger microwells will enable increasing numbers of pupae to be mounted and imaged in a single experiment. |
Heptane | Sigma | 51730-5ML | For preparation of heptane glue |
Double sided sticky tape (e.g. Scotch) | Agar Scientific | AGG263 | For preparation of heptane glue |
50ml tube (for heptane glue) | Falcon tubes from Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparation of heptane glue |
Glass microscope slides | Agar Scientific | AGL4244 | For dissection of Drosophila pupae |
Dissecting stereo microscope with brightfield | Leica (or equivalent) | M50 | For dissection of Drosophila pupae |
Microscissors | John Weiss International | 103123 | Miniature Research Scissors (straight) |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Laser ablation and imaging | |||
Nitogen ablation laser | Spectra-Physics (or Andor equivalent) | Model VSL-337ND-S | For wounding, this should be attached to a widefield imaging system |
Multilaser confocal laser-scanning microscope (CLSM) | Leica (or equivalent) | TCS AOBS SP8 or SP5-II attached to a Leica DMi8 inverted epifluorescence microscope (or equivalent) | Ideally including a motorised stage for multi-site and 'mosaic' scanning, plus ‘hybrid’ GaAsP detectors (that offer much greater sensitivity and boosting of low signal) |
Environmental chamber | Life Imaging Services (or equivalent) | "Microscope Temperature Control System" | Attached to Confocal microscope for temperature control during imaging |
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Image Analysis Software | |||
FRAP software module | Leica (or equivalent) | CLSM FRAP software module | For performing photoconversion of photoconvertible fluorophores such as Kaede |
ImageJ (image analysis software) | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.nih.gov/ij/ | Schneider, C.A., Rasband, W.S., Eliceiri, K.W. "NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis". Nature Methods 9, 671-675, 2012. |
ImageJ plugin "Manual Tracking" | National Institutes of Health (NIH) | https://imagej.net/Manual_Tracking | |
ImageJ plugin "TrackMate" | ImageJ, NIH | https://imagej.net/TrackMate | Tinevez, JY.; Perry, N. & Schindelin, J. et al. (2016), "TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking.", Methods 115: 80-90, PMID 27713081 |
Volocity (high performance 3D imaging software) | Perkin Elmer | Volocity 6.3 | For image analysis |
IMARIS (image analysis software) | Bitplane | IMARIS for Cell Biologists | For image analysis |