Этот протокол показывает, как создать надежный метод HFS мышей. Нейронов в зубчатой извилине гиппокампа электрически стимулируется HFS прямо и косвенно в естественных условиях. Активность нейронов и молекулярных сигналов, изучаются c-fos и Notch1 immunofluorescent окрашивание, соответственно; Нейрогенез количественно Бромдезоксиуридин маркировки assay.
ВЧ-электростимуляции (HFS), с помощью вживленных электродов, ориентации различных областях мозга, была доказана как эффективного лечения различных неврологических и психиатрических заболеваний. HFS в регионе глубокой мозга, также названный стимуляции глубоко мозга (DBS), становится все более важным в клинических испытаниях. Недавний прогресс в области высоких частот DBS (HF-DBS) хирургии начал распространяться возможность использования этой инвазивной техники в других ситуациях, например лечения депрессии расстройства (MDD), обсессивно-компульсивное расстройство (ОКР) и поэтому о.
Несмотря на эти расширения индикаций основных механизмов благотворное воздействие ВЧ-DBS остаются загадочными. Для решения этого вопроса, один из подходов заключается в использовании имплантированных электродов, которые редко активировать распределенных подгруппы нейронов, HFS. Сообщалось, что HFS в передние ядра таламуса может использоваться для лечения огнеупорных эпилепсии в клинике. Основные механизмы могут быть связаны с повышенной Нейрогенез и изменения активности нейронов. Таким образом мы заинтересованы в изучении физиологических изменений при обнаружении активности нейронов, а также нейрогенез в зубчатой извилине мыши (ГД) до и после лечения HFS.
В этой рукописи мы описываем методологий для HFS для активации ГД в мышей, прямо или косвенно и в острой или хронической форме. Кроме того, мы описываем подробный протокол для подготовки срезы мозга для c-fos и Notch1 immunofluorescent окрашивания для мониторинга активности нейронов и сигнализации активации и Бромдезоксиуридин (BrdU) маркировка для определения Нейрогенез после индукции HF-DBS. Активации нейронной активности и нейрогенез после лечения HF-DBS обеспечивает прямой нейробиологических доказательств и потенциальных терапевтических преимуществ. Особенно эта методология может быть модифицировать и применять другие заинтересованные мозга регионы такие как базальных ганглиев и subthalamic регионов для конкретных мозга расстройств в клинике.
ВЧ-DBS является нейрохирургические технологии для электростимуляции в мозге, который был разработан с 1870-х1. В конце 80-х HFS был впервые использован как потенциал терапевтического вмешательства для болезни Паркинсона и расстройств, другие движения2. В последние несколько десятилетий ВЧ-DBS более широко используется в лечении расстройств мозга, которые в настоящее время неизлечимыми традиционная терапевтические стратегии. В частности, за счет повышения точности HFS электрода, весьма эффективные результаты, и минимальные побочные эффекты, расстройств головного мозга лечение HF-DBS значительно участились в последние десятилетия3,4, 5. К примеру ВЧ-DBS был одобрен США продуктов питания и медикаментов (FDA) для лечения болезни Паркинсона (PD), тип деменцией Альцгеймера, необходимо тремор и другие виды движения расстройства2,6, 7. в PD больных, уменьшается дофаминергической лекарства до 50% в течение8HF-DBS. Кроме успешного лечения двигательных расстройств ВЧ-DBS также продемонстрировал свои мощные эффекты в лечении психических заболеваний в клинике и когнитивных увеличения как хорошо2,9, 10 , 11. следует отметить, что исследования HFS для лечения других психиатрических расстройств находятся на различных стадиях, предлагая много обещание пациентов12.
Хотя многие исследования показали, что фокуса HFS имеет как местных, так и удаленных эффекты во всем мозг13, неврологические и молекулярных механизмов воздействия остаются недостижимой2,14. В клинике терапевтические ВЧ-DBS обычно применяется в долгосрочной манере для лечения болезни Паркинсона и хронической боли и т.д. возникновения многих мнений объяснить порожденных ВЧ-DBS лечения, среди которых одна возможность улучшения что текущий HFS модулирует нейрональных сетевой активности, вероятно, повторяющихся деполяризации аксоны вблизи электродов имплантированных HFS. Или, ВЧ-DBS могут изменить разряда выходных нейронов и прогнозируемых показателей. Кроме того, ВЧ-DBS могут привести долгосрочные синаптических изменений, включая долгосрочные потенцирование (LTP) и долгосрочные депрессии (LTD), которая может способствовать симптоматическое улучшение. Пока, до сих пор неясно ли HFS оказывает основные молекулярные события, которые регулируют сотовых процессов, таких как взрослый нейрогенез в естественных условиях. Несколько линий исследования показали, что HFS грызунов могут подражать аналогичный нейронных ответов клинически прикладной DBS15,16. Чтобы понять основных клеточных механизмов ВЧ-DBS, в этом исследовании, мы сначала настроить в естественных условиях HFS методологии мышей в острый (один день) или хроническим (пять дней) образом. Во-вторых мы создали активационного анализа методологии для определения изменения активности нейронов и нейрогенез после доставки ВЧ-DBS.
Учитывая, что нейрональных производство от нервных стволовых клеток обильные во время эмбрионального развития, но продолжается и во взрослой жизни, гиппокампа Субгранулярная зоны является одной из основных областей, где происходит нейрогенез. Процесс нейрогенез находится под влиянием многих физиологических и патологических факторов. В некоторых случаях эпилептические гиппокампа нейрогенез, резко снизилась в17,18. Кроме того один электросудорожной терапии может значительно увеличить производство нейронов в зубчатой извилине19. Эти наблюдения предполагают, что электрофизиологических деятельность играет важную роль в регуляции взрослых Нейрогенез и синаптической пластичности в Нейроны гиппокампа. Таким образом чтобы далее продемонстрировать воздействие ВЧ-DBS на активность нейронов и нейрогенез, сначала осуществляем иммуноокрашивания assay немедленного раннего гена (IEG) c-fos который является известным маркером краткосрочных нейронной активности, в результате опыт работы20. Notch1 сигнализации также обнаружен для мониторинга сигналов активации после доставки HFS,21,,22. Кроме того мы также обнаружить нейрональных производства BrdU маркировки анализ после индукции HF-DBS в различных формах, хотя BrdU пятнать может также быть маркера для глиогенез.
В настоящем исследовании две методологии HFS приспособлены для активации гиппокампа DG прямо и косвенно. Электрод имплантируется в ГД напрямую или имплантируется в медиальной перфорантных пути (PP), который отправляет прогнозы для активации нейронов ГД. Для ВЧ-DBS индукции программируемые стимулятором представлен непрерывное стимулирование через фиксированного электрода на голову мыши. Чтобы определить последствия HFS для активации нейронов и нейрогенез, мы обнаруживаем выражение c-fos и Notch1 immunofluorescent окрашивание и количество BrdU включены позитивные нейронов в регионе гиппокампа ГД, соответственно, после HFS лечение. В частности воздействие ВЧ-DBS на нейрогенез в ГД сравниваются между острой и хронической стимуляции манере, или между прямым и косвенным стимуляции образом, соответственно.
ВЧ-DBS техника широко используется как мощный инструмент для лечения многих неврологических расстройств с 1990 года. Пока ориентир работы HF-DBS является для лечения болезни Паркинсона и основных тремор, которая привлекла большое внимание и интерес как в клинике и научное сообщество. Сущест…
The authors have nothing to disclose.
При поддержке Фонда национальной естественных наук Китая грантов, 31522029, 31770929 и 31371149 (для Haitao Wu), программа 973 (2014CB542203) из программы государственного развития фундаментальных исследований Китая (чтобы Haitao Ву), и Грант Z161100000216154 от Пекин муниципального науки и технологии Комиссии (для Haitao Wu). Авторы благодарят всех членов Haitao Wu лаборатории за их поддержку и дискуссий. Авторы благодарны чрезвычайно уникальную Лю за его помощь в отладке аппарат.
Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |