פרוטוקול זה מראה כיצד להגדיר שיטה אמינה מערכת קבצים הירארכית בעכברים. נוירונים ברחבי הכישור משוננת בהיפוקמפוס הם גירוי חשמלית על-ידי מערכת קבצים הירארכית ישירות ובעקיפין בתוך vivo. פעילות. עצבית והאיתות מולקולרית נבדקים על ידי c-פוס Notch1 immunofluorescent מכתים, בהתאמה; נוירוג’נסיס לכמת על-ידי bromodeoxyuridine תיוג וזמינותו.
גירוי בתדירות גבוהה חשמלי (מערכת קבצים הירארכית), באמצעות אלקטרודות מושתל מיקוד אזורים שונים במוח, הוכח כטיפול יעיל עבור נוירולוגיות שונות והפרעות פסיכיאטריות. מערכת קבצים הירארכית באזור עמוק של המוח, גם בשם גירוי עמוק-מוחי (DBS), הופך להיות חשוב יותר ויותר בניסויים קליניים. התקדמות אחרונים בתחום ניתוח DBS (HF-DBS) בתדירות גבוהה החלה להפיץ את האפשרות של טכניקה פולשנית זו במצבים אחרים, כגון טיפול הפרעת דיכאון (MDD), הפרעה אובססיבית-כפייתית (OCD), וכך ב.
למרות אלה אינדיקציות מתרחבת, המנגנון הבסיסי של ההשפעות המיטיבות של HF-DBS נשארים חידתי. כדי להתייחס לשאלה זו, גישה אחת היא להשתמש אלקטרודות מושתל שמפעילים בדלילות subpopulations מבוזרת של נוירונים על-ידי מערכת קבצים הירארכית. דווח כי מערכת קבצים הירארכית בגרעין הקדמי של התלמוס יכול לשמש לטיפול של אפילפסיה עקשן במרפאה. המנגנונים שבבסיס קשורות נוירוג’נסיס מוגברת ואין לשנותן פעילות. עצבית. לכן, אנו מעוניינים לגלות שינויים פיזיולוגיים על ידי זיהוי פעילות. עצבית, כמו גם נוירוג’נסיס ב הכישור משוננת העכבר (ג’י) לפני ואחרי טיפול מערכת קבצים הירארכית.
כתב יד זה, אנו מתארים מתודולוגיות עבור מערכת קבצים הירארכית למקד את הפעלת די. ג’י בעכברים, ישירות או בעקיפין, באופן אקוטי או כרוני. בנוסף, אנו מתארים את פרוטוקול מפורט להכנת פרוסות המוח c-פוס Notch1 immunofluorescent מכתים כדי לפקח על הפעילות העצבית והאיתות ההפעלה וכן עבור bromodeoxyuridine (BrdU) תיוג כדי לקבוע נוירוג’נסיס לאחר אינדוקציה HF-DBS. ההפעלה של פעילות. עצבית ו נוירוג’נסיס לאחר הטיפול HF-DBS מספק ראיות ישירות הנוירוביולוגי ויתרונות טיפוליים פוטנציאליים. במיוחד, מתודולוגיה זו יכולה להיות שונה ומוחלים כדי להתמקד באזורים אחרים במוח מעוניין כגון the הגרעינים הבזליים ואזורים subthalamic עבור הפרעות מוח ספציפיים במרפאה.
HF-DBS הוא טכנולוגיה נוירוכירורגיים סטימולציה חשמלית במוח, אשר פותחה מאז המאה ה-1. בשנות ה-80 המאוחרות, מערכת קבצים הירארכית שימש תחילה התערבות טיפולית פוטנציאל מחלת פרקינסון, הפרעות תנועה אחרת2. ב העשורים האחרונים, HF-DBS כבר יותר בשימוש נרחב לטיפול הפרעות במוח אשר נמצאים כיום חשוכת על ידי אסטרטגיה טיפולית מסורתיים. במיוחד, עקב השיפור דיוק של האלקטרודה מערכת קבצים הירארכית, תוצאות יעילות מאוד, תופעות לוואי מינימליות, מספר הפרעות מוח מטופלים על ידי HF-DBS באופן משמעותי גדל במהלך עשרות שנים3,4, 5. לדוגמה, HF-DBS אושרה על ידי מינהל המזון והתרופות האמריקני (FDA) לטיפול של מחלת פרקינסון (PD), סוג אלצהיימר של, רעד חיוני וסוגים אחרים של התנועה הפרעות2,6, 7. חולי PD, התרופה וכולינרגיים מצטמצם עד 50% במהלך HF-DBS8. בנוסף לטיפול מוצלח של הפרעות תנועה, HF-DBS הוכיחה גם השפעותיו רב עוצמה לטיפול במחלות פסיכיאטריות במרפאה, ועל הגדלת קוגניטיביים כמו גם2,9, 10 , 11. יצוין כי המחקר של מערכת קבצים הירארכית לטיפול של הפרעות פסיכיאטריות אחרות נמצאות בשלבים שונים, המציעים מבטיח הרבה חולים12.
למרות מחקרים רבים הוכיחו כי מערכת קבצים הירארכית מוקד יש השפעות הן מקומי והן מרוחק ברחבי המוח13, המנגנונים נוירולוגיות ומולקולרית של ההשפעות יישארו חמקמק2,14. במרפאה, HF טיפולית-DBS מיושם בדרך כלל באופן ארוך טווח לטיפול של מחלת פרקינסון, כאב כרוני, ועוד שהרבה דעות מגודלים להסביר את השיפור שנוצר על ידי טיפול HF-DBS, בין אילו אפשרות אחת כי הזרם מערכת קבצים הירארכית שמחליש את פעילות הרשת העצבית, כנראה על ידי דפולריזציה חוזרות של האקסונים באזור האלקטרודה מערכת קבצים הירארכית מושתל. לחלופין, HF-DBS עלול לשנות את קצב פריקה של הנוירונים פלט ואת המטרות המוקרנת. בנוסף, HF-DBS עלולה לגרום לשינויים סינפטית לטווח ארוך, לרבות הויסעגט (LTP) ודיכאון לטווח ארוך (בע מ), אשר עשויים לתרום שיפור סימפטומטי. עד כה, זה עדיין לא ברור אם מערכת קבצים הירארכית influences האירועים המולקולריים מפתח לווסת את הסלולרי תהליכים כאלה כמו למבוגרים נוירוג’נסיס בתוך vivo. מספר שורות של מחקרים הוכיחו כי מערכת קבצים הירארכית בחולדות עשויה לחקות דומה תגובות עצביות DBS קלינית יישומית15,16. כדי להבין את המנגנונים הסלולר הבסיסית של HF-DBS, במחקר זה, תחילה הקמנו של ויוו מערכת קבצים הירארכית מתודולוגיה בעכברים חריפה (יום אחד) או באופן כרוני (חמישה ימים). שנית, הקמנו מתודולוגיה הפעלה ניתוח כדי לקבוע את שינוי פעילות. עצבית ו נוירוג’נסיס לאחר הלידה HF-DBS.
בהתחשב בכך הייצור עצביים מתאי גזע עצביים הוא שופע במהלך התפתחות עובריים אך ממשיכה לאורך כל חיי הבוגרים, אזור subgranular בהיפוקמפוס הוא אחד האזורים העיקריים בו נוירוג’נסיס מתרחשת. התהליך של נוירוג’נסיס מושפע על ידי גורמים פיזיולוגיים ופתולוגיים רבים. במקרים מסויימים אפילפטי, נוירוג’נסיס בהיפוקמפוס הוא ירד באופן דרמטי17,18. בנוסף, נזעי חשמל יחיד יכול להגדיל באופן משמעותי את ייצור עצביים הפיתול משוננת19. מקרים אלה מצביעים על הפעילות אלקטרופיזיולוגיות שמשחק תפקיד מרכזי בויסות נוירוג’נסיס למבוגרים ופלסטיות סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס. לכן, להפגין עוד יותר את ההשפעות של HF-DBS על פעילות. עצבית ו נוירוג’נסיס, אנחנו קודם לבצע את וזמינותו של immunostaining של מיידית מוקדם ג’ין (הרגל) c-פוס אשר מהווה סמן ידועים של הפעילות העצבית לטווח קצר הנובע ניסיון20. Notch1 איתות מזוהה גם לעקוב אחר הפעלת איתות לאחר מערכת קבצים הירארכית משלוח21,22. יתר על כן, אנו גם לזהות ההפקה עצביים מאת BrdU תיוג ניתוח לאחר אינדוקציה HF-DBS בצורות שונות, למרות BrdU מכתים ניתן גם סמן gliogenesis.
במחקר הנוכחי, שתי מתודולוגיות מערכת קבצים הירארכית מותאמים כדי למקד את ההפעלה של די. ג’י בהיפוקמפוס במישרין ובעקיפין. האלקטרודה הוא מושתל לתוך DG ישירות או מושתל לתוך הנתיב perforant המדיאלי (PP) אשר שולח הקרנות כדי להפעיל את הנוירונים די. ג’י. עבור אינדוקציה HF-DBS, ממריץ לתכנות מוצג עבור גירוי מתמשך דרך האלקטרודה קבוע על גבי הראש העכבר. כדי לקבוע את ההשפעות של מערכת קבצים הירארכית על הפעלת עצביים, נוירוג’נסיס, אנו מזהים את הביטוי של c-פוס , Notch1 על ידי צביעת immunofluorescent ואת המספר של שילב-BrdU נוירונים חיובי באזור DG בהיפוקמפוס, בהתאמה, לאחר הטיפול מערכת קבצים הירארכית. במיוחד, ההשפעות של HF-DBS על נוירוג’נסיס בדי. ג’י משווים בין חריפה באופן גירוי כרוני, או בין ישיר ובין באופן עקיף גירוי, בהתאמה.
הטכניקה HF-DBS כבר בשימוש נרחב לטיפול בהפרעות נוירולוגיות רבות מאז שנות ה-90 ככלי רב עוצמה. עד כה, הוא ציון דרך עבודתו של HF-DBS לטיפול של מחלת פרקינסון, רעד חיוני, אשר משכה הרבה תשומת לב ועניין הן את המרפאה והן הקהילה המדעית. ישנם סוגים שונים של לימודי מתמשך HF-DBS על ידי קבוצות רבות עבור יישום טיפולי…
The authors have nothing to disclose.
נתמך על ידי קרן מדעי הטבע הלאומית של סין מענקים 31522029, 31770929 ו- 31371149 (כדי Haitao Wu), תוכנית 973 (2014CB542203) מתוכנית פיתוח המפתח המדינה למחקר בסיסי של סין (כדי Haitao Wu), גרנט Z161100000216154 מ בייג’ינג העירוני למדע וטכנולוגיה (כדי Haitao Wu). המחברים תודה לכל חברי המעבדה Haitao וו שלהם עידוד ודיונים. המחברים הם מאוד אסירת תודה ליו Zhenwei לעזרתו עם באגים המנגנון.
Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |