Dit protocol laat zien hoe u een betrouwbare HFS-methode in muizen. Neuronen in de hippocampal getand gyrus zijn elektrisch gestimuleerd door HFS direct en niet indirect in vivo. Neuronale activiteit en moleculaire signalering zijn onderzocht door c-fos en Notch1 immunefluorescentie kleuring, respectievelijk; neurogenese wordt gekwantificeerd door bromodeoxyuridine labeling assay.
Elektrische hoogfrequente stimulatie (HFS), met behulp van geïmplanteerde elektroden targeting verschillende hersengebieden, heeft bewezen als een effectieve behandeling voor verschillende neurologische en psychiatrische aandoeningen. HFS diepe regio van de hersenen, diepe hersenstimulatie (DBS), ook wel genoemd wordt steeds belangrijker in klinische proeven. Recente vooruitgang op het gebied van hoge-frequentie DBS (HF-DBS) chirurgie is begonnen met het verspreiden van de mogelijkheid van het gebruik van deze invasieve techniek naar andere situaties, zoals de behandeling van ernstige depressie stoornis (MDD), obsessief-compulsieve stoornis (OCS), en zo op.
Ondanks deze groeiende aanwijzingen blijven de onderliggende mechanismen van de positieve effecten van HF-DBS raadselachtige. Om aan deze vraag, is een benadering om het gebruik van geïmplanteerde elektroden die dun gedistribueerde subpopulaties van neuronen door HFS activeren. Er werd gemeld dat HFS in de voorste nucleus van de thalamus kan worden gebruikt voor de behandeling van refractaire epilepsie in de kliniek. De onderliggende mechanismen kunnen worden gerelateerd aan de verhoogde neurogenese en neuronale activiteit gewijzigd. Daarom zijn we geïnteresseerd in het verkennen van de fysiologische veranderingen door de detectie van neuronale activiteit, alsmede de neurogenese in de muis getand gyrus (DG) voor en na behandeling van HFS.
In dit manuscript beschrijven we methodologieën voor HFS te richten op de activering van het DG in muizen, direct of niet indirect en op een acute of chronische wijze. Daarnaast beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de bereiding van hersenen segmenten voor c-fos en Notch1 immunefluorescentie kleuring voor het controleren van de neuronale activiteit en signalering van activering en bromodeoxyuridine (BrdU) labelen om vast te stellen de neurogenese na de inductie van de HF-DBS. De activering van de neuronale activiteit en neurogenese na de behandeling van de HF-DBS biedt direct neurobiologische bewijs en potentiële therapeutische voordelen. Bijzonder, kan deze methode worden aangepast en toegepast te richten op andere interesse hersengebieden zoals de basale ganglia en subthalamicus regio’s voor specifieke hersenafwijkingen in de kliniek.
HF-DBS is een neurochirurgische technologie voor elektrische stimulatie in de hersenen, die sinds de jaren 1870-1heeft ontwikkeld. In de late jaren 1980, HFS werd voor het eerst gebruikt als een potentiële therapeutische interventie voor de ziekte van Parkinson en andere beweging stoornissen2. In de afgelopen decennia, HF-DBS heeft meer en meer wijd verbeid gebruikt in de behandeling van aandoeningen van de hersenen die momenteel onbehandelbaar zijn door een traditionele therapeutische strategie. In het bijzonder als gevolg van de verbetering van de nauwkeurigheid van de elektrode HFS, zeer effectieve resultaten en minimale bijwerkingen, het aantal hersenafwijkingen behandeld door HF-DBS aanzienlijk toegenomen in de afgelopen decennia3,4, 5. Bijvoorbeeld, is HF-DBS goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) voor de behandeling van de ziekte van Parkinson (PD), Alzheimer type dementie, essentiële tremor en andere soorten verkeer stoornissen2,6, 7. bij PD-patiënten, de Dopaminerge medicatie is teruggebracht tot 50% tijdens de HF-DBS8. Naast de succesvolle behandeling van bewegingsstoornissen, heeft HF-DBS ook aangetoond zijn krachtige effecten in de behandeling van psychiatrische ziekten in de kliniek, en voor de vergroting van het cognitieve als goed2,9, 10 , 11. opgemerkt moet worden dat het onderzoek van HFS voor de behandeling van andere psychiatrische stoornissen zijn in verschillende stadia, het aanbieden van veel beloven voor patiënten12.
Hoewel tal van studies hebben aangetoond dat een focale HFS zowel de lokale als de externe effecten gedurende de hersenen13 heeft, blijven de neurologische en moleculaire mechanismen van de effecten elusive2,14. In de kliniek, wordt therapeutische HF-DBS meestal toegepast op wijze op lange termijn voor de behandeling van de ziekte van Parkinson en chronische pijn, etc. die vele adviezen worden verhoogd om uit te leggen van de verbetering die zijn gegenereerd door een HF-DBS behandeling, onder welke één mogelijkheid dat de huidige HFS de neuronale netwerkactiviteit, waarschijnlijk door een repetitieve depolarisatie van de axonen in de nabijheid van de geïmplanteerde HFS-elektrode moduleert. Of, HF-DBS kan de snelheid van de geen kwijting van de neuronen van de uitvoer en de geschatte doelstellingen wijzigen. Ook HF-DBS kan leiden synaptic veranderingen op lange termijn, met inbegrip van lange termijn potentiëring (LTP) en op lange termijn depressie (LTD), die kan bijdragen aan een symptomatische verbetering. Tot nu toe, het is nog onduidelijk of HFS influences de belangrijkste moleculaire gebeurtenissen die regelen van cellulaire processen zoals als volwassen neurogenesis in vivo. Verschillende lijnen van studies hebben aangetoond dat HFS bij knaagdieren soortgelijke neurale reacties klinisch toegepaste DBS15,16kan nabootsen. Om te begrijpen van de cellulaire mechanismen voor HF-DBS, in deze studie, instellen we eerst een in vivo HFS methodologie in muizen in een acute (één dag) of chronische (vijf dagen) wijze. Ten tweede, we instellen een activering analyse methodologie om de wijziging van de neuronale activiteit en neurogenese na een HF-DBS-levering
Gezien het feit dat de neuronale productie van neurale stamcellen overvloedig tijdens de embryonale ontwikkeling is maar gedurende het hele volwassen leven blijft, is de hippocampal subgranular zone een van de belangrijkste gebieden waar de neurogenese plaatsvindt. Het proces van neurogenese is beïnvloed door vele fysiologische en pathologische factoren. In bepaalde gevallen epileptische is de hippocampal neurogenese drastisch verminderde17,18. Daarnaast kan een enkele elektroconvulsieve therapie de neuronale productie in de getand gyrus19aanzienlijk verhogen. Deze opmerkingen suggereren dat het elektrofysiologische activiteit een cruciale rol in de regulatie van volwassen neurogenesis en synaptische plasticiteit in hippocampal neuronen speelt. Daarom, om te verder demonstreren de effecten van HF-DBS op Neuronale activiteit en neurogenese, eerst voeren we een immunokleuring kwantitatieve analyse van de onmiddellijke vroege gen (IEG) c-fos is een bekende marker van kortlopende Neuronale activiteit als gevolg van ervaring van20. Notch1 signalering wordt ook gedetecteerd om te controleren de signalering activeren na de HFS levering21,22. Bovendien, we ook detecteren de neuronale productie door een BrdU labeling analyse na de inductie van de HF-DBS op verschillende manieren, hoewel BrdU kleuring ook een marker voor gliogenesis kunnen.
In de huidige studie zijn twee HFS methodologieën aangepast aan de doelgroep van de activering van het hippocampal DG, direct en indirect. De elektrode is geïmplanteerd in het DG direct of het mediale perforant pad (PP) die prognoses stuurt te activeren van de DG neuronen ingeplant. Voor de inductie van de HF-DBS, wordt een programmeerbare stimulator gepresenteerd voor een continu stimulatie via de vaste elektrode aan het hoofd van de muis. Om te bepalen van de effecten van HFS op neuronale activering en neurogenese, ontdekken we de expressie van c-fos en Notch1 door immunefluorescentie kleuring en het aantal positieve neuronen BrdU-opgenomen in de hippocampal DG regio, respectievelijk, na de behandeling van HFS. In het bijzonder worden de effecten van de HF-DBS op de neurogenese in de DG vergeleken tussen een acute en een chronische stimulering wijze, of tussen een directe en indirecte stimulatie wijze, respectievelijk.
De HF-DBS techniek heeft wijd gebruikt als een krachtig hulpmiddel voor de behandeling van veel neurologische aandoeningen sinds de jaren 1990. Tot nu toe is de mijlpaal werk van HF-DBS voor de behandeling van de ziekte van Parkinson en essentiële tremor, die heeft aangetrokken veel aandacht en belangstelling voor zowel in de kliniek en de wetenschappelijke gemeenschap. Er zijn verschillende soorten van lopende HF-DBS studies door vele groepen voor HF-DBS therapeutische toepassing in bepaalde neurologische en psychiatri…
The authors have nothing to disclose.
Ondersteund door de nationale natuurlijke Science Foundation van China subsidies 31522029, 31770929 en 31371149 (aan Haitao Wu), Program 973 (2014CB542203) van het programma staat belangrijke ontwikkeling voor fundamenteel onderzoek van China (aan Haitao Wu) en Grant Z161100000216154 van de Beijing gemeentelijke wetenschap en technologie Commissie (Haitao Wu). De auteurs bedanken alle leden van het laboratorium Haitao Wu voor hun aanmoediging en discussies. De auteurs zijn Zhenwei Liu zeer dankbaar voor zijn hulp bij het debuggen van het apparaat.
Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |