هذا البروتوكول يوضح كيفية إعداد طريقة أسر موثوقة في الفئران. يتم تحفيز الخلايا العصبية في جميع أنحاء المغزلي المسنن هيبوكامبال كهربائياً بأسر مباشرة وغير مباشرة في فيفو. نشاط الخلايا العصبية والإشارات الجزيئية هي دراسة ج-المنحدر وتلطيخ إيمونوفلوريسسينت Notch1، على التوالي؛ هو كمية الخلايا من بروموديوكسيوريديني وسم المقايسة.
وقد ثبت التحفيز عالية التردد الكهربائي (أسر)، استخدام أقطاب مزروع استهداف مناطق مختلفة في الدماغ، كعلاج فعال للاضطرابات العصبية والنفسية المختلفة. أسر في المنطقة العميقة من الدماغ، وتسمى أيضا تحفيز الدماغ العميق (DBS)، تزداد أهمية في التجارب السريرية. وقد بدأ التقدم الذي أحرز مؤخرا في مجال عالية التردد (HF-DBS) DBS الجراحة انتشار إمكانية الاستفادة من هذا الأسلوب الغازية في حالات أخرى، مثل العلاج لاضطراب الاكتئاب الكبرى (MDD)، الوسواس القهري (OCD)، وما إلى ذلك في.
وعلى الرغم من هذه المؤشرات الآخذة في التوسع، تظل الآليات الكامنة من الآثار المفيدة للتردد DBS ملغز. ولمعالجة هذه المسألة، هو نهج واحد استخدام أقطاب مزروع بتنشيط الفئات السكانية الفرعية الموزعة من الخلايا العصبية من أسر قليلة. وأفيد أن أسر في نواة المهاد الأمامي يمكن أن تستخدم لعلاج الصرع المقاوم للحرارة في العيادة. قد تكون مرتبطة بالخلايا زيادة الآليات الكامنة وتغيير نشاط الخلايا العصبية. ولذلك، نحن مهتمون باستكشاف التغيرات الفسيولوجية بالكشف عن نشاط الخلايا العصبية، فضلا عن الخلايا في الماوس المغزلي المسنن (DG) قبل وبعد العلاج أسر.
في هذه المخطوطة، يصف لنا منهجيات لأسر لاستهداف التنشيط للمدير العام في الفئران، مباشرة أو غير مباشرة وعلى نحو حاد أو مزمن. وبالإضافة إلى ذلك، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة لإعداد شرائح المخ ج-المنحدر و Notch1 إيممونوفلوريسسينت تلطيخ لمراقبة نشاط الخلايا العصبية والإشارات التنشيط وبروموديوكسيوريديني (بردو) وضع العلامات لتحديد الخلايا بعد التعريفي DBS التردد. تفعيل نشاط الخلايا العصبية والخلايا بعد العلاج HF DBS توفر دليل مباشر على العصبية الحيوية والفوائد العلاجية. وخاصة هذه المنهجية يمكن تعديلها وتطبيقها لاستهداف المناطق الدماغ المهتمة الأخرى مثل ganglia القاعدية والمناطق سوبثالاميك لاضطرابات الدماغ محددة في العيادة.
DBS التردد هو تقنية الجراحة العصبية للتحفيز الكهربائي في الدماغ، والتي وضعت منذ 1870s1. في أواخر الثمانينات، أولاً كأسر تدخل علاجي محتمل لمرض باركنسون واضطرابات الحركة الأخرى2. في العقود القليلة الماضية، استخدمت HF DBS أكثر وأكثر على نطاق واسع في علاج اضطرابات الدماغ التي حاليا غير قابل للعلاج باستراتيجية علاجية تقليدية. خاصة، نظراً لتحسين دقة مسرى أسر ونتائج فعالة للغاية، والحد الأدنى من الآثار الجانبية، اضطرابات الدماغ يعالجها DBS التردد إلى حد كبير زاد العدد على مدى عقود3،4، 5. على سبيل المثال، وافقت DBS التردد “لنا الغذاء” والدواء (FDA) لعلاج مرض باركنسون (PD) ونوع الخرف مرض الزهايمر والهزة الأساسية وأنواع أخرى من حركة اضطرابات2،6، 7. في المرضى PD، يخفض الدواء تتميز تصل إلى 50% خلال DBS التردد8. بالإضافة إلى نجاح العلاج من اضطرابات الحركة، أثبت DBS التردد أيضا لها آثار قوية في علاج الأمراض النفسية في العيادة، والتعزيز المعرفي ك9جيدا2،، 10 , 11-تجدر الإشارة إلى أن البحوث المتعلقة بأمن الأسرة المعيشية الغذائي لعلاج الاضطرابات النفسية الأخرى في مراحل مختلفة، تقدم الكثير من الوعود للمرضى12.
على الرغم من أن العديد من الدراسات أظهرت أن أسر المحورية قد الآثار البعيدة والمحلية في جميع أنحاء الدماغ13، تظل الآليات العصبية والجزيئية للآثار بعيدة المنال2،14. تطبق DBS HF العلاجية في العيادة، عادة بطريقة طويلة الأجل للعلاج مرض باركنسون، والألم المزمن، إلخ وتطرح العديد من الآراء لشرح تحسين تولدها معاملة DBS التردد، بين فيه إمكانية واحدة أن أمن الأسرة المعيشية الغذائي الحالي ينظم نشاط شبكة الخلايا العصبية، ربما قبل ديبولاريزيشن متكررة من محاور عصبية محيط القطب أسر مزروع. أو DBS التردد قد يتغير معدل أداء الخلايا العصبية النواتج والأهداف المتوقعة. أيضا، قد يؤدي التردد DBS التغييرات متشابك طويلة الأجل، بما في ذلك التقوية الطويلة الأجل (الكمونية) والاكتئاب الطويل الأجل (المحدودة)، والتي قد تسهم في حدوث تحسن أعراض. وحتى الآن، أنها مازال من غير الواضح ما إذا كانت عمليات أسر influences الأحداث الرئيسية الجزيئية التي تنظم الخلوية مثل كالكبار الخلايا في الجسم الحي. وقد أظهرت عدة أسطر من الدراسات أن أسر في القوارض يمكن أن تحاكي مماثلة الاستجابات العصبية سريرياً التطبيقية DBS15،16. لفهم الآليات الخلوية الكامنة من التردد-DBS، في هذه الدراسة، نحن أولاً إعداد في فيفو أسر المنهجية في الفئران في الحادة (يوم واحد) أو طريقة المزمن (خمسة أيام). ثانيا، نحن إعداد منهجية تحليل التنشيط لتحديد تغيير نشاط الخلايا العصبية والخلايا بعد تسليم DBS التردد.
نظراً لأن إنتاج الخلايا العصبية من الخلايا الجذعية العصبية وفيرة أثناء التطور الجنيني ولكن يستمر طوال حياة الكبار، منطقة سوبجرانولار هيبوكامبال هي واحدة من المجالات الرئيسية التي تحدث فيها الخلايا. عملية الخلايا يتأثر بالعديد من العوامل الفسيولوجية والمرضية. وفي بعض الحالات الصرع، هو الخلايا هيبوكامبال انخفاض كبير17،18. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن علاج اليكتروكونفولسيفي واحد إلى زيادة كبيرة في إنتاج الخلايا العصبية في المغزلي المسنن19. هذه الملاحظات تشير إلى أن النشاط الكهربية يلعب دوراً حاسما في تنظيم الخلايا الكبار واللدونه متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال. ولذلك، زيادة توضيح آثار DBS التردد على نشاط الخلايا العصبية والخلايا، أولاً نقوم بتنفيذ مقايسة immunostaining من فوري مطلع الجينات (IEG) ج-المنحدر الذي علامة معروفة لنشاط الخلايا العصبية القصيرة الأجل الناجمة عن تجربة20. أيضا يتم الكشف عن الإشارات Notch1 لمراقبة تفعيل إشارات بعد21،التسليم أسر22. وعلاوة على ذلك، نحن أيضا الكشف عن إنتاج الخلايا العصبية قبل بردو وسم التحليل بعد التعريفي DBS التردد بطرق مختلفة، على الرغم من تلطيخ بردو يمكن أن يكون أيضا علامة على جليوجينيسيس.
في هذه الدراسة، منهجيتين أسر يتم تكييفها لاستهداف تفعيل هيبوكامبال المدير العام مباشرة وغير مباشرة. مسرى مزروع إلى المدير العام مباشرة أو مزروع في المسار بيرفورانت الآنسي (PP) الذي يرسل إسقاطات لتنشيط الخلايا العصبية المديرية العامة. لتحريض DBS التردد، يرد مشجعا لبرمجة لتحفيز مستمر عبر مسرى الثابتة إلى رأس الماوس. لتحديد آثار أسر على تنشيط الخلايا العصبية، والخلايا، يمكننا الكشف عن التعبير عن ج-المنحدر و Notch1 بصبغة إيمونوفلوريسسينت وعدد بردو إدراج الخلايا العصبية الإيجابية في منطقة المديرية العامة هيبوكامبال، على التوالي، بعد علاج أسر. خاصة، هي مقارنة آثار التردد-DBS على الخلايا في المدير العام بين الحادة وطريقة تحفيز مزمنة، أو بين مباشر وطريقة تحفيز غير مباشر، على التوالي.
قد استخدمت تقنية DBS التردد على نطاق واسع كأداة قوية لعلاج العديد من الاضطرابات العصبية منذ التسعينات. حتى الآن، عمل تاريخي DBS التردد لعلاج مرض باركنسون والهزة الأساسية، التي جذبت الكثير من الاهتمام والمصلحة في العيادة والمجتمع العلمي على حد سواء. وهناك أنواع مختلفة من الدراسات الجارية با?…
The authors have nothing to disclose.
وبدعم من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية لمنح الصين 31522029 و 31770929 و 31371149 (إلى وو هايتاو)، برنامج 973 (2014CB542203) من برنامج الدولة الإنمائية الرئيسية للبحوث الأساسية للصين (إلى هايتاو وو)، ومنحة Z161100000216154 من بكين البلدية لجنة العلم والتكنولوجيا (إلى هايتاو وو). يشكر المؤلفون جميع أعضاء المختبر هايتاو وو لتشجيعهم والمناقشات. الكتاب ممتنون جداً جينوي ليو لمساعدته مع التصحيح على جهاز.
Brain stereotaxic instrument | Stoelting | 51730D | Stereotactic intracranial implantation for mouse |
Stimulator | A-M systems | Model 3800 | MultiStim 8-Channel programmable stimulator |
Dental driller | Saeshin Precision Co., Ltd | STRONG 90 | For drilling and crainiotomy |
Burr | Meisinger | HM1 005# | For drilling and crainiotomy |
Digidata 1550 Digitizer | Molecular Devices | AXON 1550 | High-resolution data acquisition |
Cryotome | Thermo Fisher Scientific | Thermo Cryotome FSE | Cutting frozen sections of specimens |
Confocal microscope | Olympus | FV-1200 | Japan, with 20x Objective (NA 0.45) |
Mouse surgery tools | F.S.T. | 14084-08,11254-20,16109-14 | Scissors, forceps, bone cutter, holders etc. |
Pentobarbital sodium | R&D systems | 4579 | 20-50mg/kg for i.p. injection |
Penicillin G | Sigma-Aldrich | P3032 | 75,000 U for i.m. injection |
Carprofen | Sigma-Aldrich | SML1713 | 5-10mg/kg, for s.c. injection |
4% Paraformaldehyde (PFA) | Beijing Solarbio Sci-Tech Co. | P1110 | stocking solution for tissue fixation |
Phosphate buffer (PBS) | Invitrogen | 10010023 | pH7.4, 500ml in stocking |
Tissue-Tek O.C.T. compound | Sakura | 4583 | Formulation of water-soluble glycols and resins |
anti-BrdU antibody | Abcam | ab6326 | Dilutions:1/800 |
anti-c-fos antibody | Abcam | ab209794 | Dilutions:1/500 |
Goat Anti-Rabbit IgG (Alexa Fluor 568) | Thermo Fisher Scientific | A11036 | Dilutions:1/500 |
Donkey Anti-Rat IgG (Alexa Fluor 488) | Jackson ImmunoResearch | 712-546-150 | Dilutions:1/500 |
Antifade mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Counterstaining with DAPI |
anti-Notch1 antibody (C-20) | Santa Cruz Biotech | sc-6014 | Dilutions:1/50 |
Donkey Anti-Goat IgG (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150073 | Dilutions:1/1000 |