Une approche de mutagenèse roman Saturation : Seule étape caractérisation des protéines régulatrices accepteurs en ARN utilisant Phosphorothioates
Özet
Les protéines qui se lient à des séquences d’ARN spécifiques jouent un rôle crucial dans l’expression des gènes. Une caractérisation détaillée de ces sites de liaison est cruciale pour notre compréhension de la régulation des gènes. Ici, une approche pas à pas pour la mutagénèse de saturation des sites de liaison protéique dans l’ARN est décrite. Cette approche est pertinente pour tous les sites de liaison aux protéines dans l’ARN.
Abstract
Régulation des gènes joue un rôle important dans le développement. Nombreuses protéines de liaison DNA et RNA lient hautement leur séquence cible pour contrôler l’expression des gènes. Ces protéines régulatrices contrôlent l’expression des gènes au niveau de l’ADN (transcription) ou au niveau de l’ARN (l’épissage de l’ARN pré-messager, polyadénylation, mRNA transport, décomposition et traduction). Identification des séquences régulatrices aide à comprendre non seulement comment un gène est activé ou désactivée, mais aussi quels gènes en aval sont réglementés par une protéine régulatrice particulière. Nous décrivons ici une approche une étape qui permet de mutagénèse de saturation d’un site de fixation de protéines dans l’ARN. Il s’agit de dopage la matrice d’ADN avec les nucléotides non-sauvage au sein de l’accepteur, la synthèse d’ARN séparés avec chaque nucléotide phosphorothioate et l’isolation de la fraction liée après incubation avec les protéines. Interférence de nucléotides non-sauvage se traduit par leur exclusion préférentielle de la fraction liée aux protéines. Ceci est contrôlé par électrophorèse suivant un clivage chimique sélectif avec l’iode des liaisons phosphodiester contenant phosphorothioates (phosphorothioate mutagénèse ou PTM). Cette approche de mutagenèse seule étape saturation est applicable à la caractérisation de n’importe quel site de liaison des protéines dans l’ARN.
Introduction
Régulation des gènes joue un rôle important en biologie. Gènes peuvent être réglés au niveau de la transcription, épissage de l’ARN pré-messager, 3′ fin formation, exportation RNA, traduction, localisation de l’ARNm, carie, modification poteau-de translation/stabilité, etc. les deux protéines de liaison à l’ADN – et l’ARN jouent un rôle clé dans le gène Règlement. Alors que les analyses de génétiques moléculaires ont identifié de nombreuses protéines régulatrices, seulement un petit sous-ensemble d’eux ont été caractérisés entièrement pour leurs fonctions cellulaires ou de sites de liaison in vivo. Mutagenèse et analyse phylogénétique séquence offrent des approches complémentaires pour caractériser les interactions ADN – ou ARN-protéine.
Protéines de liaison à l’ARN sont importants dans le processus de développement, y compris la différenciation sexuelle. La protéine de Drosophila Sex-lethal (SXL) ou la protéine sex-interrupteur général est absente dans les mâles, mais présent chez les femelles. Il reconnaît les séquences riches en uridine ou pyrimidiques adjacentes aux sites d’épissage spécifiques dans les cibles du pré-ARNm en aval (transformateur, Sex-lethalet spécifique aux mâles lethal2) dans les cellules somatiques1,2 ,3,4. En outre, il réglemente polyadénylation site commutation en se liant aux séquences enhancer riche en uridine polyadénylation dans renforceur de rudimentaires (e(r)) transcription5,6. SXL probable réglemente des cibles supplémentaires dans les cellules germinales femelles qui restent à être identifiés1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Caractérisation d’un site de liaison implique généralement, mutagenèse, par exemple, par la suppression ou la substitution d’un ou de plusieurs nucléotides. Chaque site de liaison mutant, par rapport à la séquence d’ARN sauvage, est ensuite analysée à l’aide d’une série de concentrations de protéines afin de déterminer son affinité (Kd ou équilibre de dissociation constante) pour la protéine d’intérêt ; Kd est la concentration de protéines nécessaire pour obtenir 50 % ARN contraignantes. Ce processus fastidieux de la mutagénèse détaillé implique la génération et l’analyse de nombreux mutants — trois nucléotides non-wild type pour chaque poste dans le site de liaison. Ainsi, il y a un besoin pour une approche différente pour la mutagénèse de saturation plus rapide, plus simple et peu coûteux de sites de fixation de protéines dans l’ARN.
Nous décrivons ici une approche une étape qui permet de mutagénèse de saturation d’un site de fixation de protéines dans l’ARN. Il s’agit de dopage la matrice d’ADN avec les nucléotides non-sauvage au sein de l’accepteur, la synthèse d’ARN séparés avec chaque nucléotide phosphorothioate et l’isolation de la fraction liée après incubation avec les protéines. Interférence de nucléotides non-sauvage se traduit par leur exclusion préférentielle de la fraction liée aux protéines. Ceci est contrôlé par électrophorèse suivant un clivage chimique sélectif avec l’iode des liaisons phosphodiester contenant phosphorothioates (phosphorothioate mutagénèse ou PTM). Cette approche de mutagenèse seule étape saturation est applicable à la caractérisation de n’importe quel site de liaison des protéines dans l’ARN.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutagenèse a longtemps été utilisé pour caractériser les sites de fixation des protéines. Tout d’abord, une série de mutants peut être construite et testée individuellement en tests d’analyser leurs effets sur l’affinité de liaison. Alors qu’une approche de mutagenèse standard offre la possibilité d’analyser plusieurs séquences, plusieurs étapes impliquées dans l’approche standard, comme construire des mutants et exécutent une série de réactions pour chaque mutant de liaison, est laborieux e…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L’auteur remercie les National Institutes of Health, le financement passé et Merci Michael R. Green pour la synthèse d’oligonucléotides.
Materials
| Uridine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-017 | |
| Adenosine 5’ a-thio triphosphate | NEN (Boston, Massachusetts) | NLP-016 | |
| Vacuum manifold | Fisher Scientific | XX1002500 | Millipore 25 mm Glass Microanalysis Vacuum Filter |
| Vacuum manifold | Millipore | XX2702552 | 1225 Sampling Vacuum Manifold |
| Nitrocellulose | Millipore | HAWP | |
| Nitrocellulose | Schleicher & Schuell | PROTRAN | |
| Dephosphorlyation Kit | NEB | M0508 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | M0201S | |
| Proteinase K | NEB | P8107S | |
| T7 RNA polymerase | NEB | M0251S | |
| RNasin | Promega | RNase inhibitor | |
| Glass Plates | Standard | Standard | |
| Gel Electrophoresis equipment | Standard | Standard | |
| X-ray films | Standard | Standard | |
| Polyacrylamide gel solutions | Standard | Standard |
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