Les protocoles sont décrits pour évaluer la toxicité des chimies de moustiques adultes et immatures pour développement en tant que de nouvelles classes de larvicides et adulticides, endectocides. Les protocoles permettent à haut débit stable des chimies multiples à la dose de monopoint et évaluation ultérieure par dosage réponse dose pour déterminer la toxicité au contact ou par ingestion.
Nouvelles classes d’insecticides avec nouveaux modes d’action sont nécessaires pour contrôler les populations de moustiques qui transmettent des maladies comme le paludisme, la dengue et la Zika résistant aux insecticides. Dosages pour rapide, haut débit analyses des informulé chimies roman contre les larves de moustiques et des ailés sont présentés. Les auteurs décrivent des protocoles pour unique point-dose et dose réponse tests pour évaluer la toxicité des chimies de petites molécules au vecteur Aedes aegypti de Zika, la dengue et la fièvre jaune, le vecteur du paludisme, Anopheles gambiae et le Nord moustique de la maison, Culex quinquefasciatus, au contact et par ingestion. À titre d’exemple, nous avons évalué la toxicité de l’amitriptyline, un antagoniste de petites molécules de récepteurs couplés aux protéines G, par l’intermédiaire de larve, adulte topique et adulte qui se nourrissent de sang dosage. Les protocoles offrent un point de départ pour étudier le potentiel insecticide. Résultats sont discutés dans le cadre d’expériences supplémentaires à explorer des applications de produits et de mécanismes de livraison.
Les moustiques transmettent les agents responsables des maladies infectieuses qui influent sur la santé humaine dans le monde1. Les trois genres de moustiques plus importants affectant la santé humaine sont Aedes, Anopheles et Culex. Les espèces de moustiques du genre Aedes vecteur l’arbovirus qui causent Zika, dengue, fièvre jaune et chikungunya. Anophèle vecteur de parasites du paludisme et l’espèce Culex transmettre le virus du Nil occidental et les nématodes filarienne2. L’organisation mondiale de la santé (OMS) a appelé à l’élimination de dix Neglected Tropical maladies (NTD) par 20203 et identifié la lutte contre les moustiques comme la stratégie plus viable. Les insecticides sont des outils puissants pour combattre les moustiques et réduire la maladie transmission4,5. Cependant, l’émergence des populations de moustiques résistant aux insecticides menace le contrôle continu de nombreuses maladies6,7,8. Le Consortium novateur de contrôle vectoriel (IVCC) a lancé le premier effort consacré à développer des insecticides de remplacement pour mosquito control9. Nouveaux insecticides avec nouveaux modes d’action (PA) sont nécessaires pour atteindre les objectifs qui et maîtriser la maladie. La découverte et le développement de nouvelles classes d’insecticide avec roman MoAs nécessitent des essais de tout l’organisme pour l’analyse rapide et à haut débit des chimies et par rapport aux normes de l’industrie10.
Plusieurs tests sont disponibles pour évaluer la répulsion et la toxicité des insecticides pour les larves et les moustiques adultes, et certains sont appropriés pour l’évaluation des nouvelles chimies formulés ou non formulées. Le protocole OMS11 est un dosage de contact utilisé pour tester des produits contre le quatrième stade larvaire. Études publiées décrivent également une variété de larves essais utilisés pour tester la toxicité des chimies de petites molécules pour les larves d’Aedes aegypti, Anopheles gambiae et Culex quinquefasciatus10,12, 13,14,15,16. Les Centers for Disease Control and Prevention (CDC) bouteille bioessai sert à évaluer la résistance aux insecticides dans les populations de moustiques adultes via l’évaluation de la concentration létale (LC) et temps létal (LT) par rapport à une norme diagnostique champ pris dose d’un insecticide commercial17. Le test de sensibilité WHO propose une autre approche pour évaluer la résistance aux insecticides dans les moustiques adultes par laquelle les moustiques sont exposés à papier imprégnée d’insecticide à l’intérieur de flacons en verre pendant 1 h et la mortalité est évaluée à 24 h18. Autres épreuves pulvériser des formulations à l’intérieur des cages scellées et de mort et de choc de moustique record à désirée h19. L’application topique au thorax moustique a été utilisée pour évaluer la puissance des différents pesticides20. La mise en place d’essais d’insecte Liverpool (LITE)21 emploie des modes opératoires normaliséspour évaluer la bioactivité des chimies de moustiques adultes. Le dosage d’actualité adult LITE s’applique une petite quantité de produit à l’essai sur le thorax de moustiques adultes avec mortalité a marqué 48 h. Le dosage permet la quantification de la dose reçue par chaque moustique21. Le test de Tarse LITE évalue la toxicité du produit à l’essai aux moustiques adultes reposant sur une surface traitée chimiquement et sert à identifier les chimies avec potentiel de développement sous forme de pulvérisations résiduelles d’intérieur (IRS) ou utilisation de moustiquaires traitées-insecticide (MII) pour contrôler les moustiques anophèles .
L’OMS et dosages de CDC ont des limites pour tester les chimies de roman, informulées, et l’objectif de l’essai biologique bouteille de CDC est l’évaluation de la sensibilité sur une période d’essai court (deux heures) au lieu de toxicité22,23. En outre, des essais pour l’évaluation de la toxicité des chimies envoyées dans le repas de sang et potentiels pour le développement de produits à action systémique (c.-à-d. les endectocides) font défaut. Nous décrivons ici les essais pour tester l’activité tuant des moustiques des chimies nouvelles qui sont solubles dans l’eau ou l’un de plusieurs solvants organiques contre les larves et les adultes de Aedes, Anopheles et Culex. Tout d’abord, nous démontrons un dosage larvaire précédemment décrite par notre groupe de13,12,10,16et représenté ici comme (1) un écran pour évaluer rapidement plusieurs chimies à point unique dose, et (2) un essai de réponse dose pour déterminer la concentration létale (p. ex., LC50, LC75 ou LC90,) d’une composition chimique unique. Ensuite, nous décrivons deux adultes essais pour la détermination de la dose létale (DL). Le premier d’entre eux est une adaptation du protocole LITE pour tester des chimies appliqués topiquement, roman contre les moustiques adultes par rapport à un contrôle positif. Le second est une analyse alimentaire pour l’évaluation des chimies livré systématiquement par le repas de sang.
Les insecticides sont des outils puissants pour lutter contre les maladies transmises par les moustiques telles que Zika26, la dengue et le paludisme,25. L’utilisation des insecticides vaste a produit les populations de moustiques que sont résistants à la lutte chimique, conduisant au développement de la résistance aux insecticides, ce qui est considéré comme la plus grande menace pour continue contre la maladie. La dernière décennie a connu une augmentation dramatique des populations d’ anophèles SPP. résistance aux pyréthrinoïdes synthétiques (SPs) utilisés dans des moustiquaires en Afrique,7. Populations d’ Aedes albopictus, vecteur de la dengue et Zika, ont été signalés en Floride et du New Jersey qui résistent aux organophosphorés6. De même, la résistance au DDT et pyréthrinoïdes a été documentée dans les populations d’anophèles et Aedes SPP Colombie27,28. Il est urgent de développer de nouveaux larvicides et adulticides qui se lient aux divers orthosteric ou sites allostériques sur des cibles moléculaires connus ou qui perturbent les nouvelles cibles (p. ex., roman chimies de MoA)29,30 et avoir un impact environnemental minime. Il augmente également la reconnaissance du potentiel autour d’endectocides pour mosquito control31,32,33.
Afin de faciliter le développement rapide de ces produits, les auteurs décrivent une série de protocoles visant à évaluer la toxicité des chimies de petite molécule aux larves de moustiques et aux adultes par l’intermédiaire de deux itinéraires de livraison – contact et ingestion. Protocoles, tels que le test de sensibilité des WHO et le test en flacon CDC sont utilisées pour l’évaluation de la toxicité et la répulsion des existants des formulations insecticides1,2. Toutefois, ces tests ont des limites pour les analyses des entités chimiques nouvelles informulées (RCE) et ne se prêtent pas à l’expérimentation d’un grand nombre de produits chimiques à débit modéré ou élevé.
Nous décrivons ici un essai normalisé de larve afin d’évaluer rapidement les RCE en dose unique qui s’adapte à des analyses à haut débit. Nous décrivons également une adaptation d’un test mis au point par la LITE21 pour évaluer la toxicité par contact des chimies de petites molécules de moustiques adultes. Enfin, nous décrire un test ingestion afin d’évaluer la toxicité des RCE envoyées par l’intermédiaire de la farine de sang aux moustiques femelles adultes et explorer endectocide potentiel. Ces tests de larves et les adultes peuvent être effectués sur un éventail de doses afin de déterminer les valeurs LC et LD, respectivement, et essais de contacter les larves et les adultes peuvent être effectuées par rapport à une ou plusieurs formulations chimiques existantes. Le dosage d’actualité adult permet également le calcul des valeurs LD par moustique individuel. Les protocoles peuvent être effectuées à l’aide d’espèces d’Aedes, Anopheles et Culex16,29 et pourraient être modifiées pour tenir compte de la spécificité biologique d’une espèce, si vous le souhaitez. Dans notre expérience, tuant des moustiques chimies présentent généralement large activité dans ces trois genres16,29, mais il y a valeur d’évaluation de la sélectivité de l’espèce.
Les dosages sont un point de départ pour dépister rapidement plusieurs chimies pour activité insecticide. Ces produits chimiques qui présentent une toxicité dans un ou plusieurs essais pourraient choisir pour approfondir les analyses via des analyses secondaires et tertiaires. Citons le dosage du tarse LITE et sucre alimentation dosages34,35. La sélection des essais supplémentaires est normalement déterminée par considérations autour de marché prévue et application, avec résultats offrant aperçu des modes de prestation de produits possibles. Dans les résultats représentatifs présentés ici, nous explorons la toxicité de l’amitriptyline, un antagoniste des récepteurs de dopamine chez les mammifères et les invertébrés qui a été évalué pour le potentiel comme un roman MoA insecticide10,12, 13 , 16. amitriptyline présentait une toxicité pour les larves et les adultes de Ae. aegytpi dans la gamme μg suggérant larvicides et adulticidal activité et fournissant la justification pour une exploration d’une série de produits chimique axée sur l’amitriptyline pour identifier analogues à haute puissance. Aucun effet significatif sur la mortalité ou la fécondité a été observée chez Ae. aegypti exposés à l’amitriptyline dans le repas de sang. Alors qu’on ne connaît pas la stabilité de la chimie dans le sang défibriné et la dose efficace reçue par les moustiques, limites notables de l’essai, les données suggèrent qu’amitriptyline et autres composés de GPCR actifs peuvent avoir peu de potentiel comme endectocides, à moins dans l’état non formulée.
Précautions afin de limiter la variation biologique entre dosages sont essentielles. Tous les essais doivent être effectuées dans des conditions normales de température et d’humidité, de préférence dans une chambre de croissance des insectes, afin de garantir la reproductibilité. Il est impératif de normaliser les procédures pour la notation des critères phénotypiques comme ceux-ci peuvent être très subjectives, conduisant à une variation importante dans les données enregistrées par le personnel des laboratoires différents. L’essai de larve est mieux adapté à l’évaluation des produits chimiques qui sont solubles dans l’eau, bien que l’analyse peut être effectuée à l’aide de solvants organiques comme le DMSO, pourvu que la concentration finale est inférieure à 1 % / puits. Nous reconnaissons plusieurs limites à l’analyse de l’actualité adulte. Tout d’abord, il faut travailler rapidement lors de la préparation des dilutions sériées et livrant des doses que le transporteur (acétone) est très volatil et évaporation peut produire des variations d’un montant de chimie livré. En second lieu, il faut limiter la période de l’anesthésie car cela peut contribuer à la mortalité. Il est à noter aussi que les solvants comme l’acétone peuvent produire un effet « knock-down » rapide dans les premières heures plusieurs de l’essai d’actualité, qui ne doit pas être confondu avec les effets dus à la chimie de l’épreuve. Nous notons que le volume de la farine de sang du moustique varie entre les individus, ce qui complique l’évaluation de la dose reçue par adulte dans l’essai d’ingestion adultes. Enfin, données du test n’est pas dans les cas où la mortalité des témoins négatifs dépasse 10 %.
Les produits qui agissent en synergie sont plus en plus reconnues pour leur potentiel d’étendre l’utilité des produits existants et fournir un contrôle des parasites résistants insecticide populations15,16,36. Tests de larves ont été utilisés pour examiner la synergie entre le pesticide formamidine, amitraz et une variété de produits chimiques qui perturbent l’octopamine invertébrés récepteurs14,15. Le dosage larvaire et adulte analyse topique décrit sont appropriés pour évaluer les effets synergiques ou additifs entre les combinaisons des chimies de test. Nous notons que synergistes comme pipéronyl butoxyde (PBO) peuvent être incorporés dans chacun des trois essais décrits ici.
Les essais décrits ci-dessus fournissent une série expérimentale standardisée pour l’évaluation des médicaments informulée, petite molécule contre les stades aquatiques et terrestres de moustique. Ces tests sont conçus pour évaluer la toxicité et offrent plusieurs avantages par rapport aux existants des analyses en commun usage. Ce qui est important, les dosages peuvent faire l’objet d’automatisation et peuvent être effectuées à l’échelle industrielle pour permettre l’évaluation de milliers de composés d’essai. Enfin, comme le champ considère le développement de produits qui agissent par l’intermédiaire de nouveaux protocoles d’accord, y compris par l’intermédiaire de perturbation des nouvelles cibles moléculaires et les voies biochimiques, il sera essentiel de marquer plusieurs points de terminaison phénotypiques en sus de ceux tels que la mortalité et paralysie. Les essais ci-dessus permettent de telles enquêtes, fournissant ainsi une étape vers les technologies insecticide très innovantes de demain.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient H. Ranson, Liverpool School of Tropical Medicine pour l’aide au développement de test et disposition du protocole LITE, et M. Scharf, Université de Purdue pour obtenir des conseils concernant le dosage de conception.
Insecticide susceptible mosquito strains | Malaria Research and Reagent Reference Repository | https://www.beiresources.org/MR4Home.aspx; Recommended strains: Aedes aegypti Liverpool (LVP) strain, Anopheles gambiae Kisumu (KISUMU1) strain and Culex quinquefasciatus Johannesburg (JHB) strain | |
Acetone | Mallinckrodt Chemical | CAS 67-64-1 | Use for dilutions and control |
Amitraz | Sigma-Aldrich | CAS 33089-61-1 | Requires dilution in DMSO |
Amitriptyline | Sigma-Aldrich | CAS: 549-18-8 | Can be diluted in acetone |
Bifenthrin | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Synthetic pyrethorid used as positive control |
Cis-(Z)-flupenthixol | Sigma-Aldrich | CAS: 51529-01-2 | Pharmacologically tested as disruptor of dop-like receptors |
Defibrinated rabbit blood | Hemostat | DRB0100 | Blood source for adapted mosquitoes to artificial feeding |
Dimethylsulphoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | MKBF2985 | Organic solvent used to disolve amitraz |
Hemotek membrane feeding system | Hemotek Ltd | Serial no. 1303 | Used for feeding mosquitoes |
Micro-applicator | Burkard Manufacturing Co. | – | Tool needed for topical application experiments |
24-well cell culture plate with lid | Corning Incorporated | 3526 | – |
Advantage rubber bands | Alliance Rubber Co. | – | Used to seal the paper cups |
Glass syringe (1 ml) | Becton Dickinson and Co. | 512004 | Needed for the micro-applications. Glass is better than plastic |
Disposable scintillation vials (20 ml) | Fisher Scientific | 74505-20 | Glass vials prevent evaporation |
Tulle fabric, white | Walmart | – | – |
Paper cups | Dixie Consumer Products LLC. | PF15675/13D | Used to keep adult mosquitoes in adult topical assays |
Petri dishes (150 mm) | Corning Life Sciences | – | Used to maintain the mosquitoes "slept" on cold without direct contact with ice |
Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-7M | Used to sort larvae |
Stereo microscope | Olympus | SZ6045 | Used to score larval assays and perform micro-applications |
Tweezers (fine) | Fontax | – | Used to handle adult mosquitoes |