X 선 결정학 및 생물 기술에 의해 면역 글로불린 겹와 Glycoproteins의 특성

1. 당단백질 ECD에 대 한 디자인 구성 인간의 CD22의 아미노산 시퀀스를 평가 (Uniprot) 단백질48,49내에 있는 예측된 도메인 요소와 경계를 식별 하는 InterPro 및 Phyre2 서버를 사용 하 여. 복제 인간의 CD22, 신호 펩타이드, 막 횡단 및 cytosolic 도메인 (잔류물 20-687, 여기서 부터는 CD22 extracellular 도메인, CD22 ECD) 사용 하 여 제한 효소 AgeI 및 KpnI (pHLsec 포유류 식 벡터25 에 부족의 순서 그림 2 A) 50.참고: pHLsec 벡터25포유류 세포 있는 수용 성, 분 비 단백질의 overexpression에 최적화 되어 있습니다. 이 벡터 녹는 glycoproteins의 세포 외 분 비에 대 한 허용 하도록 분 비 신호를 포함 되어 있습니다. pHLsec에는 고정된 금속 친화성 크로마토그래피 방법을 사용 하 여 셀 supernatants에서 친 화력 정화를 촉진 하기 위하여 C-터미널 (그의)6 x 태그를 포함 되어 있습니다. C-터미널 Ig 도메인 순차 삭제 CD22 ECD의 잘린된 구조 복제: 1-6 (잔류물 20-687), 1-5 (잔류물 20-592) 도메인, 도메인 1-4 (20-504 잔류물) 도메인과 도메인 1-3 (20-330 잔류물) (그림 2B와 2c)50 . NetNGlyc 서버를 사용 하 여 예측된 N 연결 glycosylation 사이트 구문51에 식별 CD22 ECD의 기본 시퀀스를 평가 합니다. 사용 하 여 사이트 지시 된 mutagenesis, 표준 프로토콜52 또는 PCR53, 중복 변형 각 예측된 N 연결 glycosylation 사이트 (Gln에 Asn 또는 Asn Ala) CD22 ECD의 단일 또는 몇 가지를 포함 하는 구조를 만드는 N 연결 glycosylation 돌연변이입니다. 유능한 대장균 변환 순서 확인 후 복제 구문, DH5α 세포54 와 맥시 prep (제조 업체의 지침)에 따라 DNA transfection에 대 한 준비. 2. HEK293F 및 HEK293S 셀 설립 참고: 필요한 시 약 및 장비를 가진 HEK293F 또는 HEK293S 세포의 모든 조작 적당 한 biosafety 캐비닛에 biosafety 수준 2 시설에서 수행 되어야 합니다. 모든 항목의 외부 표면 70% 에탄올 솔루션 또는 해당 시는 살 균 되어야 합니다. HEK293F 및 HEK293S 현 탁 액 셀 ( 재료의 표참조)을 얻기까지 사용 하기 위해 준비-80 ° C에서 저장. 미디어 따뜻한 ( 재료의 표참조)를 37 ° C 물 욕조에 1 h. 환풍구 뚜껑 125 mL 당황된 셀 문화 플라스 크를 따뜻하게 미디어의 24 mL를 전송 합니다. 1 mL 셀 aliquot-80 ° C 및 얼음 전송에서 얻을. 부분적으로 세포를 해 동 약 1 분 동안 37 ° C 물 욕조에 셀을 품 어. 셀의 1 mL 유리병에서 125 mL 당황된 셀 문화 플라스 크 포함 하는 미디어 전송. 발명 캡 셀 문화 플라스 크 그리고 장소 플라스 크 37 ° C, 130 rpm, 습도 70% 및 8% CO2로 설정 통에 닫습니다. 3. HEK293 세포 유지 보수 참고: 셀 밀도 세포의 생존 해야 녹고 후 약 24 시간 체크. 이 단계는 세포 접종; 다음 복구 보장 초기 생존 해야한다 > 80%. 신중 하 게 신선한 현 탁 액 셀을 포함 하는 125 mL 플라스 크에서 셀의 10 µ L을 제거 하 고 살 균 1.5 mL microtube에 그것을 전송. 플라스 크를 닫고 인큐베이터를 반환 합니다. 셀을 포함 하는 1.5 mL microtube로 Trypan 블루 솔루션의 10 µ L를 플라스틱, 철저 하 게 혼합 하 고 세 슬라이드의 약 실에 10 µ L를 전송. 자동 셀 카운터로 세 슬라이드를 넣고 (셀 mL-1단위로) 셀 밀도 세포 생존 능력 (비율)에 대 한 값을 얻을. ~0.8 x 106 셀 mL-1 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 최종 밀도에 신선한 200 mL 문화를 예방 하는 데 필요한 것이 셀의 볼륨을 계산:(1)(2)참고:이 걸릴 수 있습니다 ~ 200 mL 문화에 접종에 대 한 적합 한 세포 밀도를 5 d. 일단 셀 밀도 200 mL 문화의 접종에 대 한 충분 한, 37 ° C에 1 시간 워밍업 미디어 목욕 물 하 고 biosafety 캐비닛으로 따뜻하게 미디어를 전송. 발명된 모자와 함께 500 mL 당황된 셀 문화 플라스 크에 필요한 양의 (서 방정식 2에서 계산 된) 미디어를 전송 신중 하 게 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 미디어가 있는 500ml 당황된 셀 문화 플라스 크에 (방정식 1에서에서 계산) 현 탁 액 셀의 필요한 볼륨 전송. 새로운 200 mL 유지 보수 재고 모자 고 인큐베이터에 그것을 반환 합니다. 약 3 x 106 세포 mL-1의 밀도를 세포를 성장 한다. 통로 106 세포 mL-1 x 0.8의 조밀도에 셀 셀 (섹션에서에서 설명한 대로 3.4-3.7)의 안정 된 문화를 유지 하기 위해 매일 2-3 d. X 106 세포 mL-1~ 4의 밀도 초과 하는 세포를 허용 하지 않습니다. 4. 당단백질 식 HEK293 세포의 transfection 계산 볼륨 세포 transfection 0.8 x 10에 대 한 200 mL 문화에 필요한 미디어의6 mL-1 (섹션 3.4에서에서 식 1 및 2 사용 하 여) 세포.참고: 수행할 수 있는 200 mL transfections 수 유지 보수의 세포 밀도에 따라 달라 집니다. 발명된 모자와 함께 새로운 500 mL 셀 문화 플라스 크에 미디어와 transfection에 대 한 셀의 필요한 볼륨을 전송 하 고 인큐베이터에 셀 주식을 반환 합니다. 셀 분할에 따라 순응을 셀 수 있도록 transfection 전에 1 시간을 품 어. 살 균 50 mL 원뿔 튜브로 50 µ g의 DNA 전송 및 미디어의 5 mL로 희석. 진공 0.22 μ m 여과 시스템을 사용 하 여 다른 무 균 튜브에 희석된 DNA 필터링. 혼합 희석, transfection 시 약 질량: 볼륨 1:1 비율에 DNA 필터링. 부드럽게 혼합 하 고 10 분 동안 실내 온도에 솔루션을 품 어 DNA: transfection 시 약 해결책을 소용돌이 친다. 셀에 직접 DNA: transfection 시 솔루션을 추가 합니다. 37 ° C, 130 rpm, 습도 70% 및 8% CO2 5-7 d 통에 transfected 세포를 품 어. 5입니다. 세포 Transfection 조건의 최적화 참고: 최대 당단백질 수율에 대 한 세포 transfection 조건 최적화, transfect 세포 초기 셀 밀도의 다양 한에서와 시간(그림 3)에 단백질 수율을 평가. 섹션 4에서에서 설명한 대로 셀을 transfect, 초기 셀 밀도 0.5 x 10에서 배열에서 2 x 106 6 mL-1 55셀. 시험 transfections (125 mL 당황 하 고 세포 배양 플라스 크)에 25 mL 전체 볼륨을 공간 및 시 약 하기 DNA의 6 µ g으로 확장할 수 있습니다. DNA의 양을 최적화 된55를 수도 있습니다. 모든 하루 후 transfection (일 1-7), (biosafety 내각)에서 멸 균 1.5 mL microtube 세포 배양에서 500 µ L 약 수를 전송할. 컬렉션 직후는 microcentrifuge에서 5 분 12000 x g에서 aliquoted 세포를 스핀. 모든 샘플 얻을 때까지 상쾌한 새로운 1.5 mL microtube 및 4 ° C에 게 전송 합니다. Densitometry에 의해 분 비 당단백질을 quantitate 모든 샘플은 얻은 각각의 aliquot 20 µ L 새로운 1.5 mL microtube로 시음 하 고 6 µ L의 4 x Laemmli 샘플 버퍼를 비 감소와 함께 혼합. 샘플 온도 블록에서 95 ° C에서 5 분 동안 끓인 다. microcentrifuge에서 12000 x g에서 1 분에 대 한 샘플을 회전 합니다. 10 잘 4-15% 그라데이션 SDS 페이지 젤 잘 당 각 샘플의 20 µ L을 로드 합니다. 단백질 크기 마커 대 한 차선을 포함 합니다. 트리 스/글리신/SDS 버퍼에 20 분에 대 한 250 V에서 젤을 실행 합니다. 젤 Coomassie 전송 실행된 완료, 다음 20 분 대 ( 재료의 표참조) 얼룩 ddH2O 20 분 이미지 젤 젤 드 얼룩. Densitometry ImageJ, 표준 프로토콜57,58다음을 수행 합니다. 컴파일하고 x 축에 ‘일 후 transfection’와 데이터 플롯 및 y 축(그림 3)에 ‘ densitometry 값’.참고: 또는, 단백질 발현 SDS 페이지 시각화에 대 한 충분 하지 않은 경우 부 럽 같은 기술을 수 있습니다 사용된56. 씨에 의해 분 비 당단백질을 quantitate 씨59를 사용 하 여 분 비 당단백질의 금액을 quantitate Ni NTA 바이오 센서를 사용 하 여. 컴파일하고 x 축에 ‘일 후 transfection’와 데이터를 플롯과 ‘단백질 농도 (µ g/mL)’ y (그림 3A). 6. HEK293 상쾌한에서 수용 성 당단백질의 정화 4 ° c.에 20 분 동안 6,371 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수확 CD22 ECD 분 비를 포함 하는 상쾌한을 유지 하 고 0.22 μ m 필터를 사용 하 여 필터링 합니다. 로드에 미리 equilibrated 4 mL 분-1 에서 상쾌한 벤치탑 크로마토그래피 시스템을 사용 하 여 (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 5mm 이미) Ni NTA 열 (5 mL 볼륨).참고: 다른 선호도 기반 정화 기술은 사용할 수 있습니다, 제 1에서 구조 디자인에 포함 된 선호도 태그에 따라. 3-4 열 량 (CV) 워시 버퍼 (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 5mm 이미)의 유사성 열 세척 표면에 뜨는 로드, 다음. 분수 (그림 3B)를 수집 하는 동안 차입 버퍼 (20 m m Tris pH 9.0, 150 m NaCl, 500mm 이미 m)의 4-100% 그라데이션 (4 CVs)을 사용 하 여 열에서 순화 된 당단백질 elute 15 분 동안 또는 샘플 500 µ L의 볼륨에 도달할 때까지 4 ° C에서 4000 x g에서 centrifuging 여 10 kDa 공칭 분자 무게 제한 (NMWL)와 집중 된 원심 여과 장치에 eluted 피크를 포함 하는 풀 분수. 500 µ L 샘플 루프 및 미리 equilibrated (20 mM Tris, pH 9.0, 150 mM NaCl)에 0.5 mL 분-1 에 부하 집중된 당단백질 주입 고속 단백질 액체 크로마토그래피 (FPLC)에 높은-성능 크기 제외 열 (약 24 mL 볼륨) 분수 (그림 3C)를 수집 하는 동안 4 ° C에서 시스템. SDS 페이지 젤 eluted 분수 분수를 포함 하는 당단백질을 식별 하기 위해 실행 하 고 해당 분수 수영장. SDS 페이지 젤60섹션 5 설명 된 대로 실행할 수 있습니다. 7입니다. 정화 당단백질의 Deglycosylation 크기 배제 크로마토그래피 280에서 흡 광도 사용 하 여 다음 순화 된 단백질의 농도 측정 nm 소멸 계수 (예: 1.418 M-1 c m-1 CD22 ECD에 대 한)로 나눈 값.참고: 관심사의 단백질의 이론적인 소멸 계수 계산할 수 있습니다 ExPASy ProtParam61같은 서버를 사용 하 여. 10 µ L 1 X 엔 H 버퍼 (제조 업체의 지침)에 따라 상업 효소의 순화 된 단백질의 1 밀리 그램의 비율로 37 ° C에서 1 시간에 대 한 엔도 H로 순화 된 단백질을 품 어.참고: 엔도 H 앞 생산 높은 노 오 스 glycans HEK293S에서 각 glycosylation 사이트21에서 단일 GlcNAc moiety를 떠나. 엔도 H는 다른 효소 (예를 들어,PNGaseF24)이이 목적을 위해 사용할 수 있습니다 HEK293F 셀22에서 생산 하는 단백질에 glycans를 쪼개 하지 않습니다. Deglycosylated ECD 500 µ L에 집중 하 고 높은-성능 크기 제외 열 (약 24 mL 볼륨)도 H를 제거 하 고 모든 결과 집계를 분리 하는 FPLC에 0.5 mL 분-1 에 젤 여과 착 색 인쇄기를 실행. 다운스트림 실험에 사용 될 때까지 4 ° C에서 deglycosylated 단백질을 저장 합니다. 8입니다. Glycoproteins의 결정 화 참고: 상업적으로 사용 가능한 화면을 사용 하 여 결정 화 실험을 수행 하 고 앉아 드롭 실험 결정 화 로봇을 사용 하 여 설정 합니다. 집중, ECD에 10 mL-1 원하는 농도 얻을 때까지 10 kDa NMWL 4000 x g (4 ° C)에서 원심 여과 장치를 사용 하 여 deglycosylated. 280에서 흡 광도 사용 하 여 단백질 농도 결정 및 소멸 계수에 의해 나누어. 이전 샘플에서 원치 않는 먼지나 다른 오염 물질을 제거 하는 결정 화 실험 4 ° C에서 5 분 동안 12000 x g에서 원심 분리기 샘플. 저수지를 채우기 96 잘 앉아의 우물 상업적인 결정 화면에서 80 µ L 화 솔루션의 결정 화 접시를 드롭.참고: 우리는 스파스 매트릭스 상업 화면 설계 된 구조는 PDB에 관하여 가장 성공적인 결정 화 조건에 따라 사용 합니다. 200의 총 드롭 볼륨으로 결정 화 접시의 우물에 상품을 특 면 결정 화 로봇을 사용 하 여 1: 1의 순화 된 단백질: 결정 화 솔루션의 비율로 nL. 전체 접시는 적절 하 고, 일단 표시 및 자외선 빛 접시 영상 검사에 테이프와 장소 접시를 봉인. 초기 당단백질 크리스탈 안타 게 하는 조건을 식별 하기 위해 표시 하 고 자외선 빛을 사용 하 여 결정 화 접시 즉시 설치, 다음 그리고 다음 주에 검사 합니다. 더 크리스탈 크리스탈 히트 또는 임의의 행렬 마이크로 시드 방법62,63,,6465의 조건에 따라 좋은 스크린을 사용 하 여 초기 결정 화 안타에서 얻은 최적화. 곳을 알아내는 보호 어떠한 결정 라도 어머니에 크리스탈을 몸을 담글 하 여 결정 화 조건 내에서 충분 한 곳을 알아내는-막는 부족 주류 20% (v/v) 글리세롤 솔루션과 보완 솔루션 (또는 동등한 곳을 알아내는-막는, 에틸렌 글리콜 등 또는 폴 리 에틸렌 글리콜 400)입니다. Cryoloops 및 플래시 마운트 크리스탈 홈 소스 diffractometer 또는 싱크 로트 론 방사선을 사용 하 여 데이터 수집 전에 액체 질소에 그들을 동결. 9. 무거운 원자 Derivatization를 사용 하 여 단계적으로 참고: 전에 하 화합물의 조작, 안전 측면 고려 되어야 한다. 단백질 결정학에서 사용 되는 화합물 생물학 분자를 그들의 강한 유사성에 대 한 선택를 하 하 고 장기간된 노출에서 인간의 건강에 위험을 포즈. HA 화합물 그들의 물질 안전 데이터 시트에 언급 된에 대 한 적절 한 안전 조치를 취할. 테스트 하려면 다른 하 화합물, 농도 및 부 화 시간을 매달려 드롭 수증기 유포 방법66를 사용 하 여 24-잘 결정 화 접시에 8 절에서에서 얻은 잘 diffracting 크리스탈 재현 합니다. 결정 하 되 크리스탈 derivatization 사용. 서버 (예를 들어, 무거운 원자 데이터베이스 시스템67) 그들은 단백질 결정 화 상태에 대 한 적절 한 보장 하 복합 선택, 지원할 수 있습니다.참고: 하 스크린 가장 효과적인 하 화합물 단계적으로 조정의 쉬운 심사에 대 한 상업적으로 사용할 수 있습니다. “매직 7” 하 화합물의 집합 이전 HA derivatization68에 대 한 성공의 높은 가능성을가지고 설명 했습니다. HA(그림 4)를몸을 담글에 대 한 워크스테이션을 설정 합니다. 빠르게 전송는 cryoloop를 사용 하 여 0.2 µ L 하의 최종 농도가 1-20 m m에서에서 배열 되도록 결정 화 조건에 희석 HA 솔루션을 포함 하는 22 m m 커버 슬립에 드롭 크리스탈. 방울을 봉인 하 고 시간 (그림 4B)의 서로 다른 길이 대 한 품 어. 좋은 출발점은 5, 10, 60, 및 90 분와 하룻밤. 시각적으로 가능한 균열 또는 당단백질 크리스털 또는 크리스털 derivatization에 불리 한 효과 나타낼 수 있는 색상의 변화를 식별 하는 가벼운 현미경으로 결정을 검사 합니다. 마운트 cryoloops에서 결정 및 다시 담가 크리스탈 30 s 3 연속 0.2 µ L에 20% (v/v) 글리세롤 (또는 다른 곳을 알아내는-막는) 보충 포함 어머니 주류 솔루션 상품69. 결정에 다시 몸을 담근 채 하 복합 였던 비 특히 부분 인 약한 HA 바인딩에 의해 발생 감소를 제거 합니다. 플래시 동결 결정 액체 질소 (그림 4B). 데이터 수집, 처리, 구조 솔루션, 그리고 세련미, 앞에서 설명한 프로토콜26,70,,7172사용 합니다. 10. 몸으로 그것의 Ligand와 당단백질 결정 교수형-드롭 증기 확산 방법을 사용 하 여 24-잘 결정 화 접시에 8 절에서에서 얻은 잘 diffracting 결정을 재현 합니다. 20 mM Tris, pH 9.0, 150 m NaCl m에서에서 50 m m ligand의 재고 솔루션을 준비 합니다.참고:는 ligand의 농도 당단백질에 선호도 따라 준비 되어야 한다. 선호도 알 수 없는 경우 메서드를 사용 하는 ITC (섹션 12.2) 등 몸으로 실험 시작 전에 선호도 결정 해야 수 있습니다. ligand 필요한 버퍼에 원하는 농도에서 수용 성 인지 확인 합니다. 드롭 포함 ECD 결정 하는 리간드의 다양 한 농도 추가 하 고 시간 길이 5 d 5 분 사이에 부 화에 대 한 드롭 인감. 시각적으로 형태에 가능한 변화를 식별 하는 가벼운 현미경으로 결정을 추적 합니다. Cryoloops 및 곳을 알아내는 결정 탑재-어머니 주류 솔루션 20% (v/v) 글리세롤 (또는 에틸렌 글리콜 또는 저 분자 무게 폴 리 에틸렌 글리콜 400 등 다른 곳을 알아내는-막는) 보충에서 그들을 보호69. 앞에서 설명한 프로토콜73,,7475을 사용 하 여 데이터 수집, 처리, 구조 솔루션 및 수정, 있습니다. 11. 단편 항 원 바인딩 (팹)의 생산 유전자 팹 무거운 체인 (HC) 및 안티-ECD 항 체, 예를 들어,epratuzumab의 가벼운 체인 (LC) 시퀀스에 해당 하는 subclone참고: 또는, IgG 수 수 죽 습 효소 papain Fab 조각76를 생성 하 여. 다음 수정 섹션 4에서 설명한 대로 셀을 transfect: 문화의 200 mL 당 90 µ g의 팹 조각의 transfection에 대 한 DNA의 총 질량을 사용 합니다. HC 및 LC 플라스 미드 LC 이합체 형성의 양을 줄이기 위해 2:1 비율에 transfect 외피의 7d, 후 세포를 수확 하 고 상쾌한을 유지 한 0.22 μ m 진공 기반 여과 장치와 필터. 벤치탑 크로마토그래피 시스템을 사용 하 여 PBS 버퍼에서 안티-LC (카파 나 람다) 선호도 열 equilibrate참고: 지금까지 이면 LC 이합체 형성 문제 정화 동안에 단백질 G 친화성 크로마토그래피 카파/람다 LC 친 화력 정화 대 안으로 사용할 수 있습니다. 상쾌한 선호도 4 mL 분-1열에 로드 합니다. 샘플 로드, 다음 3-4 CVs PBS를 가진 열을 씻어. 100mm 글리신, pH 2.2, 즉시 중화 10% (v/v) 1 M eluted 분수와 isocratic 차입을 사용 하 여 열에서 단백질을 elute 트리 스, 각 분수에 pH 9.0.참고: eluted 팹 수 더 정화 이온 교환 크로마토그래피 / 크기 배제 크로마토그래피는 FPLC를 사용 하 여 4 ° c.에 의해 12.는 당단백질에 바인딩 하는 팹 및 작은 분자의 특성 Biolayer 간섭계 1x 속도 론 버퍼 (1 x PBS, 0.002% (v/v) 트윈 20, 0.01% (w/v) BSA) 50 mL를 준비 합니다. 6. 바이오 센서 Ni NTA 사전 일로 판에 10 분에 대 한 1 x 속도 론 버퍼의 200 µ L에서 하이드 레이트. 그의 태그 ECD 25 ng µ L-1의 최종 농도에 1x 속도 론 버퍼의 1 mL에 희석. 500 nM의 높은 농도와 250의 후속 직렬 희석 속도 론 버퍼, x 1의 200 µ L로 순화 팹의 직렬 희석 플라스틱 nM, 125 nM, 그리고 62.5 nM. Aliquot 시 약 같이 그림 5A, 블랙 플랫 바닥 폴 리 프로필 렌 96 잘 microplate에 각각 잘 표시 된 솔루션의 200 µ L을 포함. 38,,3977 (그림 5A) 이전에 설명 된 대로 데이터 수집 소프트웨어에 활동 분석 실험을 사용 하 여 데이터를 수집 합니다. 간단히, 우물 속도 론 버퍼 기준 60 x 1에 바이오 센서를 전송 s 240에 대 한 당단백질의 25 ng µ L-1 을 로드 하기 전에 s (또는 1.0의 임계값까지 nm에 도달) 1000 rpm. 60의 두 번째 기준 후 속도 론 버퍼, x 1에는 s에 웰 스 팹의 직렬 희석을 포함 하는 바이오 센서 전송. 180 s 협회 단계 이후에 속도 론 버퍼 x 1에서 180 s 분리 단계 뒤.참고: 바이오 센서 다시 사용할 수 있습니다 위의 프로토콜 버퍼 (500mm 이미와 PBS) 스트립에 바이오 센서 세척의 3 주기를 이루어져 있는 재생 단계 다음 5 s 뒤 5 중화에 대 한 속도 론 버퍼 x 1에서 s. 바이오 센서는 10 ~ 20까지 다시 사용할 수 있습니다 시간 같은 날 또는 가난한 데이터까지 품질 관찰 됩니다. (그림 5A) 분석 소프트웨어를 사용 하 여 데이터 분석: 아래 탭 1, 가져오기 및 선택 데이터. 탭 2, 단계 1: 데이터 선택, 선택 ‘ 센서 선택 ‘ 및 하이라이트 참조 웰 스 (행 E와 F, 그림 5A), 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 잘 참조로 설정. 단계 2: 빼기, 선택 ‘ 참조 웰 스 ‘. 단계 3: y 축 정렬에서 0.1 59.8의 시간 범위에서 ‘베이스 라인’을 선택 s. 간 단계 보정 단계 4: ‘분리에 맞춤’을 선택 단계 5: 프로세스, 선택 ‘Savitzky Golay 필터링’과 언론 과정 데이터. 탭 3 선택 ‘협회와 분리’ 분석 하는 단계는 1:1 모델. ‘글로벌 피팅’ 및 ‘색상으로 그룹’을 선택 합니다. 곡선을 클릭 마우스 오른쪽, ‘색상 변경’을 선택, 당신의 선택의 색깔에 모든 커브를 설정. ‘맞는 커브’를 선택 합니다. 데이터는 잘 적합 하, 만약 ‘ 보고서 저장 ‘을 선택 하 여 보고서를 내보낼 수 있습니다. 팹 인식에 다른 glycoforms의 HEK293F 및 HEK293S 세포 (5)에서 생산 하 고도 H 치료 (7) 경우는 효과 평가 하기 위해 다음과 당단백질으로 실험을 반복 합니다. 또한, 팹 준수할 ECD 잘림은 도메인에 대 한 통찰력을 제공 하는 실험을 반복 합니다. 팹 당단백질 상호 작용의 등온선 적정 열 량참고: 여기서 설명 하는 ITC 실험 자동된 ITC 악기를 사용 하 여 수행 됩니다. 실험은 하단 96 잘 블록 라운드 1 mL에서 수행 됩니다. ECD와 팹 20 mM Tris, pH 8.0, 밤새 저 어 바와 4 ° C에서 150 m m NaCl의 단일 4 L 비 커에 dialyze. 집중 dialyzed ECD와 팹 5 µ M, 50 µ M, 각각, 사용 하기 전에 4 ° C에서 5 분 동안 4000 x g에서 버퍼 집중 막 투 석의 5 mL로 세 번 세척을 보장 10 kDa NMWL와 원심 필터를 사용 하 여.참고: 셀에 주사기 샘플 사이의 버퍼에 어떤 불일치 ITC 실험 및 데이터에서 품질의 결과 발표를 원치 않는 열을 발생할 수 있습니다. 에 대 한 실험 1: 400 µ L a 1 셀에 로드할 수를 ECD의 그리고 120 µ L를 주사기에 로드 잘 A2에 팹의 추가. 잘 A3 혼합된 샘플 다음 실험 완료 반환 하려면 비어입니다. 각 후속 실험 순서에서 판에 추가할 수 있습니다 (즉, 실험 2: 셀-A4, A5, 주사기-빈 잘-A6; 그림 5 B)입니다.참고: 포함 버퍼 버퍼 컨트롤 (악기를 잘 작동 확인)에 시작 하 고 각 실행으로 주사기에 샘플에 대 한 희석의 열을 계산 하기 위해 버퍼 (에 셀) 컨트롤에 (주사기)에 ligand의 끝에. 이 희석의 열 해야 다음 뺄 원시 실험 데이터에서 데이터 분석 (그림 5B) 중 계산. 각 주입에 대 한 2.5 μ의 볼륨으로 총 16 주사를 실행 합니다. 주사 기간은 5 s, 180 s 간격 주사. 750 rpm의 교 반 속도와 5의 필터 기간 25 ° C 셀 온도 설정 s.참고: 선호도 및 ECD:Fab 상호 작용의 열역학에 따라, 그것은 샘플 농도, 수의 주사 또는 셀 온도 변경 하려면 필요할 수 있습니다. 앞에서 설명한40,,4143 (그림 5B) 분석 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다. 중복, 말은 KD 값과 표준 오류 계산에서 적어도 실험을 반복 합니다. 팹: 당단백질 상호 작용의 열역학에 glycoforms의 다른 glycoforms (섹션 5와 6) 경우는 효과 평가 하기 위해 ECD와 실험을 반복 합니다. 리간드-당단백질 상호 작용의 등온선 적정 열 량, ITC 실험 다음 변경 섹션 12.2에 설명 된 대로 설정: Dialyze 투 버퍼의 4 L에 ECD 하룻밤. 투 석의 완료 다음 투 석 버퍼를 사용 하 여 리간드를 분해. 낮은 친 화력 상호 작용을 검출 수 상당히 높은 농도에서 ITC 실험을 수행 합니다. ECD와 ligand 상호 작용에 대 한 셀에는 주사기에 ligand의 1mm ECD의 100 μ M의 농도에서 ITC 실험을 수행 합니다.