Biolayer 干渉計、等温滴定型熱量計、x 線結晶構造解析、免疫グロブリン倍で糖タンパク質の構造と特性評価のためのアプローチを提案します。
細胞表面の糖タンパク質は、シグナリング、密着性と輸送を含む細胞の機能に重要な役割を果たします。白血球、免疫グロブリン (Ig) ひだを持っているこれらの糖タンパク質のいくつかと免疫認識と制御の中心であります。デザイン、表現、CD22 ヒト B 細胞受容体の細胞外ドメインの生物物理特性評価のためのプラットフォームを紹介します。これらのアプローチが広く Ig ドメインを含む哺乳類の糖タンパク質 ectodomains の評価に適用されることを提案します。2 懸濁液人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 細胞ライン、HEK293F、HEK293S は、複雑で高マンノース糖鎖をそれぞれきょくひ糖タンパク質を表現する使用されます。異なる従ってこれら遺伝子組換え糖タンパク質糖鎖のサイズおよびリガンド結合の組成の影響を調査を許可します。動態と生体関連配位子および治療用抗体の候補者に糖タンパク質結合の熱力学的性質を研究するためのプロトコルについて述べる。HEK293S 細胞における組換えタンパク質結晶化糖鎖の均一性、減らされた柔軟性とエンドグリコシダーゼ H 治療への感受性のために適しています。重原子と小分子リガンド結合の解析と位相決定の糖タンパク質結晶をそれぞれ浸漬法を提案します。説明する実験的プロトコルはここでその機能への洞察力を与えるし、治療薬の作用のメカニズムを調査する哺乳類の糖タンパク質のキャラクタリゼーションのための約束を保持します。
表面タンパク質は、細胞の機能に重要な役割を果たします。細胞外ドメインをこれら膜タンパク質は、細胞間相互作用、接着、トランスポートおよび1,2の信号を調節することが。これらの蛋白質の細胞局在化させるがんと自己免疫疾患3,4,5を含む病気の広い範囲の治療薬の開発のための魅力的なターゲット,6,7. ひと膜タンパク質 ectodomains の最も一般的なひだの 1 つは、7 つ以上の β ストランド 2 つの β シート8,9に配置によって形成される免疫グロブリン様 (Ig) 倍。通常、Ig 含有糖タンパク質、細胞外膜タンパク質10部に配置された順番に Ig ドメインとマルチ ドメイン構造です。これらの細胞表面タンパク質、特に N と O リンク糖の翻訳後修飾は、折りたたみ、分泌および機能11それらの規制に重要な役割を再生する示されています。技術が必要な機能とそれらを対象とするより良いデザイン治療に理解を改善するために、その詳細な分子特性を可能にします。今回、生物物理を可能にする技術の組み合わせ (biolayer 干渉法 (結合) と等温滴定型熱量計 (ITC)) と Ig 含有細胞外ドメインの構造 (x 線回折) の評価膜糖蛋白、だけで、複雑な生体関連配位子と治療上の分子 (図 1)。
N リンク糖鎖は哺乳類タンパク質は、最も一般的な翻訳後修飾の一つし、小胞体とゴルジ体12,13内タンパク質成熟中に発生します。人間の萌芽期の腎臓 (HEK) 293 細胞などの細胞は、糖タンパク質14,15の大量の組換え発現のため開発されています。スケール付着性のセルラインに比べて大量にタンパク質の生産アップのしやすさでは、サスペンションの形式でこの細胞ラインを開発しました。2 HEK293 細胞を利用するここでは、: HEK293F と HEK293 Gnt 私-/- (HEK293S)、私が N アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ トランスフェラーゼの有無によって異なる (Gnt 私) 後者で。ターンでは、(に見られる HEK293F) として複雑な糖鎖の生産は不可能であり、代わりに高マンノース型糖鎖 (主に男5GlcNAc2) 存在の N 型糖鎖のサイト18,19,20.同時にこれら 2 つのセルラインを使用して生物学的機能と治療ターゲットに及ぼす糖鎖の大きさや複雑さを勉強できます。確かに、糖タンパク質 HEK293F の細胞で生産されるだろう HEK293S 細胞で生産される同じ糖蛋白と比較して大きくより複雑な糖鎖HEK293S 細胞で生産される糖タンパク質の N 結合糖鎖の減らされた化学と構造の不均質性のため、結晶化に向いています。Crystallizability をさらに向上させるため、HEK293S (しかしない HEK293F) 細胞で生産される糖タンパク質は酵素エンドグリコシダーゼ高マンノース糖鎖の開裂の結果このような H (遠藤 H) を扱うことができるだけである、単一 n-アセチルグルコサミン (GlcNAc)部位は各糖鎖の N リンク サイト21,22のままです。他の方法は、kifunensine23を含む糖蛋白中に糖転移酵素阻害剤の添加などの細胞内の N 型糖鎖の処理を制限する使用できます。代替アプローチは、(HEK293F 細胞) のネイティブ糖タンパク質のペプチド N 各種グリコシダーゼ F (PNGaseF) を用いた酵素の糖鎖切り出し続いて式を含みます。ただし、PNGaseF と糖鎖切り出しの原産の条件およびいくつかの蛋白質の増加の集計の下でより少なく有効であること示されています。場合蛋白質のまま治療後、水溶性を取得アスパラギン酸24アスパラギン残基の脱あみどのため表面に負電荷、結晶化について有害な可能性もあります。アラニンやグルタミン残基、これらのサイトで N リンク グリコシル化反応を防ぐために、均質性の高い糖タンパク質サンプルを生成するためにほとんどの場合、N 糖鎖が予測も変異することができます。また、糖タンパク質は、酵母、昆虫、植物システム チャイニーズハム スター卵巣 (CHO) 細胞16,17など他の哺乳類セルラインなど他の真核生物細胞培養で製作できます。
PHLsec を含む多くの哺乳類発現ベクター細胞中25に組換え糖タンパク質 ectodomains の分泌を可能にします。HEK293 細胞から糖タンパク質の分泌細胞の換散を必要とせず簡便・迅速な浄化が可能です。精製タグの追加 (例えば、彼タグ、タグ、連鎖球菌フラグ-タグ、Myc タグ、HA タグ) ターゲットの N または C 末端に糖タンパク質によりシングル ステップ アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーによって浄化。その後、サイズ排除クロマトグラフィーは、構造と生物の単分散のサンプルを生成する使用できます。
適切な条件の下で高純度、均一な糖タンパク質サンプルは、よく回折結晶で起因できます。このような結晶による x 線回折データセットを取得すると、初期段階は糖タンパク質の電子密度を計算する決定する必要があります。構造蛋白質のデータ ・ バンク (PDB) で数増え、おかげで段階的に廃止のため最もよく使用されるメソッドまで関連タンパク質の構造を使用して初期段階の26を取得する分子置換 (氏) となっています。しかし、氏は、時折マルチ Ig ドメイン糖タンパク質27,28,29のためのケースをされている位相問題を解決するために失敗した場合、別の方法が必要です。この記事は、CD22 外部ドメイン28の構造を解決するために必要でした、段階的に廃止の重い原子 (HA) と結晶を吸収する方法を詳しく説明します。段階的に廃止のため右 HA を識別するは、与えられた結晶格子と結晶化ソリューション30,31糖蛋白質で使用可能な原子 HA 反応性に依存する反復的なプロセスです。糖タンパク質は、他の原子に十分に高い比率で存在する場合と十分に高い冗長性32、x 線回折データを収集できるのシステインとメチオニン残基の自然硫黄原子を使用ことができますまた、 33。
膜糖タンパク質の生物学的機能しばしばによるタンパク質-タンパク質相互作用やタンパク質-リガンド相互作用など、炭水化物。リガンド認識を理解する糖タンパク質-リガンド共結晶構造を取得する成功はリガンドが結晶格子の糖蛋白結合部位にソリューションから拡散するには十分に小さいと、浸漬実験できます。
ここに示すプロトコルは合成治療配位子34,35 ・抗体治療36,37表面糖タンパク質の相互作用を理解することも。構造情報と組み合わせると、動力学および熱力学をバインディングは強力な理解し、それらの作用メカニズムを改善できます。抗体医薬品の糖蛋白に結合の速度論的解析では、1 つの手法は、バリ38,39です。バリは、最終的に平衡解離定数 (KD) を決定するバインドのパートナーと協会・解離動態を測定するのに固定化リガンドとバイオ センサーを使用します。糖タンパク質の少量が必要なので、バリは魅力的なアプローチ (< 100 μ g)、実験時間は高速 (10 ~ 15 分ごとに実行)、自動化できます。ITC はまた糖タンパク質と結合パートナー40,41,42,43の間の類似性を調べる場合に役立ちます。ITC は、多くの時間と集中的な試薬ですが、(ΔG、ΔH、ΔS、および化学量論) の相互作用の熱力学に関する貴重な情報を取得できます。ITC は、配位子に表面糖タンパク質の一過性のバインディングに関連付けられては、しばしば弱い相互作用を研究するため便利ですも。さらに、これらの技術は、さまざまなコンストラクトのバインディングの異なる N リンク従って細胞の糖蛋白質を表現することから得られる効果を評価すると共に使用できます。HEK293F、HEK293S で生産され、遠藤 H で治療は糖タンパク質とバリと ITC を実行する生物学的活性と治療的関与の糖鎖の役割の詳細なビューを提供できます。
我々 は正常に人間 CD22 の28、糖タンパク質ファミリのメンバー、シアル酸結合 Ig のようなレクチン (Siglecs)44 B 細胞の恒常性を維持するために不可欠な細胞外ドメイン (ECD) を特徴づけるこれらのプロトコルを適用.結晶化を容易にするために詳細な構造設計を行い段階的に Hg で浸漬 ha x 線データセット。我々 はまた CD22 結晶そのリガンドのシアル酸 (α 2-6/シアリルラクトース) 免疫受容体-リガンド複合体の構造を取得するを浸漬し、したがって糖ヒューマンミメティック最前線45,46の構造に基づく設計のための青写真を提供します。さらに、私たちはバリでの親和性を決定するため抗 CD22 抗体 epratuzumab – 非ホジキン リンパ腫47の第 III 相臨床試験で現在治療候補 – のフラグメント抗原結合 (Fab) を生成し、糖鎖特異的に ITC CD22 ECD を構築します。これらの研究では、B 細胞の機能不全 CD22 認識のための潜在的な影響と epratuzumab 婚約の N 結合糖鎖の重要な役割を明らかにしました。
膜糖タンパク質細胞機能のために重大、魅力的な治療上のターゲット。ここで、両方単独でそして小分子リガンド複合体膜糖タンパク質の ECD の構造と特性のプロトコルを提案し、Fab フラグメントします。我々 は正常に人間 CD2228、チェック79体液性免疫を維持に関与する B 細胞の重要な共受容体の細胞外の部分の 3 つの N ターミナルほとんど Ig ドメインの結晶構造を決定するのにこのプロトコルを使用しています。またその天然リガンドの α 2-6/シアリルラクトースと CD22 の結合部位を特徴として人間 CD22 に向けて治療用抗体の認識のモードを定義します。これらの結果は、B 細胞と新しい CD22 のターゲットを絞った小分子と抗体を用いた開発に向けた分子ロードマップの表現が制限されている Siglecs 家族の主要メンバーの構造と機能の関係に洞察力を提供します。治療。このプロトコルは Ig 含有 B 細胞受容体を正常に使用されますが、異なるドメインの組織とすべての膜の糖蛋白質の構造と特性評価のためのアプローチを適用できることを提案します。このような場合は、設計とコンビナトリアル N 型糖鎖構造の結晶成長と高分解能回折に適したを見つけるため (Gln または Ala のいずれか) の突然変異を評価できるを構築します。
均一な純粋な糖タンパク質サンプルを取得下流生物物理学的特性だけでなく、結晶成長と x 線回折のため非常に重要です。N リンク糖鎖糖タンパク質の存在は本質的に不均一し、結晶の形成を抑止することができます糖内構造および化学的不均質性を引き起こすことができます。このマイクロの不均一性を減らすためには、ハーバーの N 結合糖鎖、または endoglycosidases (遠藤) などによる治療が続く突然変異細胞株 (HEK293S) などを使用して、予測した Asn 残基を削除する点変異を導入する戦略がかなり結晶化成功15,21,22を向上します。このプロトコルでは可溶性糖タンパク質・細胞培養上清中に分泌される工場の浄化をについて説明します。糖タンパク質の分泌は、セル換散の必要性や過酷な化学物質や洗剤の添加なしの純度への比較的単純なルートを提供します。細胞培養上清、得られた次セル収穫は (例えば、 Ni 国税庁彼の付けられた糖蛋白質、またはすてきなフラグメントの LC の親和性のため) の興味の蛋白質のための親和性を持つ列の上に直接実行されます。ただし、使用、細胞培養上清 (例えばpH) の条件の列によって列に興味の蛋白質のバインディング機能が影響されるかもしれない。この場合、集中し、バッファーの列へのバインドを改善するために細胞培養上清を交換する必要があります。さらに、浄化中の品質管理手順が蛋白質の純度を評価するために採用するを強くお勧めします。SDS ページのゲルまたは (の前に、中に、浄化のステップの後) すべてのサンプルの西部のしみを実行するかどうか提案された浄化方式は興味の蛋白質に洞察力を得ることができます。汚染バンドは SDS のページに表示された場合、またはいくつかの種は精製時に得られる (例えば、サイズ排除上のいくつかのピーク)、追加精製の手順を実行する必要があります考慮するを得るために、例えば、イオン交換クロマトグラフィー下流の結晶化80の純度と増加のチャンス。
高分子結晶化の結晶のヒットを見つけることができます多数の高蛋白濃度で潜在的な結晶化条件のスクリーニングのために興味の蛋白質の高収率を取得する重要です多くの場合。一般的には、HEK293 細胞株に記載 (HEK293F と HEK293S) は堅牢な表現システム、必要に応じてより多くのサンプルを生成するためのスケール アップ。ただし、興味の蛋白質可能性がありますこれらの細胞内で十分に表現できないことが可能です。これらのケースで Expi293 細胞81,82, などの他の細胞は蛋白質の表現の優れたレベルを示すことが判明し、代替手段として考慮されるべき。
整然、回折結晶が次の高純度にもかかわらず興味の蛋白質のいくつかの構造の試験を得られない場合は、結晶の形成を促進する結晶化技術を拡大する必要があります。それは、抗体と nanobodies の Fab 断片が優れた結晶化エンハンサーをするでき、よく整理されたクリスタル83,84,85を包装を促進する示されています。これらのフラグメントの表現し、同質性に浄化され、興味の蛋白質との複合体の結晶化を促進するために使用することができます。重要なは、Fab 断片セクション 10 で説明されているように生成することができます非機能的な LC ダイマー86を形成する傾向があります。これらの汚染物質をおよび精製中に削除する必要があります。我々 の経験で LC ダイマーしばしばサイズ排除に別の保存ボリュームがあるイオン交換クロマトグラフィーに明瞭なピークとして溶出や削除できるから Fab 浄化 – しかし、これは常にそうではありません。これらの技術は工場の精製から LC ダイマーを削除するための十分な G タンパク質の親和性の浄化などの他の浄化方法は、純度を向上させるために使用できます。
Fab 断片と co 錯形成する代わりに、ランダム行列 microseeding など定評の技術は、よく整理された結晶63,70を得ることのチャンスを向上できます。このメソッドは、結晶の結晶成長を促進するために核を提供する結晶化条件に粉砕、準結晶の少量の付加を含みます。これは、ドメイン アーキテクチャ及び三次構造が類似したものや、興味の蛋白質の結晶を使用して実行できます。さらに、単独で、タンパク質を結晶化しよう、Fab フラグメントまたは関心の低分子との複合体は、ランダム行列 microseeding を実行できます。クライオ電子顕微鏡の最近の進歩はまたこの手法に適切な機能87,88、分子の高分解能構造情報を取得するための x 線の結晶学への魅力的な代替手段を作る 89,90,91。
氏によって失敗すると x 線回折データセットの段階的に廃止、浸漬 HA を異常分散または同形置換による位相問題を解決するために必要かもしれない。タンパク質のアミノ酸配列の検査は、バインディングの最適 pH を含む HA の誘導体化の戦略についての手がかりを提供できます。特に、対になっていないシステイン蛋白質の内で特に水銀 HA 化合物をバインドできます。ネイティブ結晶 HA 化合物を浸漬は、最適な HA 化合物の id、その濃度および必要なインキュベーション時間を決定するための反復的なプロセスです。浸漬の初期の試みには、よく回折結晶段階に適した HA を含む譲歩しない場合、は、HA 結合確率と異常信号を改善するアミノ酸置換を導入する必要があります。などの変異体を効率的に位相の異常に使われた大腸菌セレノ メチオニン補足のメディアの異常な段階の Hg、Au、Pt や Pb タンパク質の発現をバインドする無料のシステイン残基が含まれてしかし、。セレノ メチオニンが確実に組み込まれた同等のシステムはサスペンション92,93, 哺乳類セルの容易に利用可能ではないと将来の開発の領域です。
興味の糖タンパク質のリガンド非結合構造を取得した後、小分子リガンドと結晶を沈める免疫受容体-リガンド複合体の構造を取得する実行できます。これらのデータより具体的かつ高親和性リガンド糖蛋白の生物学的機能に高解像度の洞察力を提供と同様、低分子治療薬として使用することができます合理的な設計の青写真を提供します。興味の小分子リガンド糖タンパク質結晶を吸収しようとすると、リガンド非結合状態の結晶構造の検査は浸漬で可能かどうかを指定できます。場合すぐ水晶パッキング連絡先リガンド結合部位の周りがあるまたはリガンド結合に伴う構造変化を受けると予想される地域では、問題が発生する可能性が高いを浸漬します。この場合、タンパク質-リガンド複合体の共晶析法など他の方法を実行する必要があります。
The authors have nothing to disclose.
ビームライン 08 ID、08 BM 技術革新・自然科学・ エンジニア リング研究評議会カナダのカナダの財団によってサポートされているカナダの光源で本稿で説明した x 線回折実験を行い、カナダ保健研究機構、国立研究評議会カナダ西部経済の多様化カナダ サスカチュワンの政府サスカチュワン大学ITC とバリの商品へのアクセスの病気の子供のため構造 & 生物物理の中核施設、病院を確認したいと思います。J.E.O. は、バンティング博士研究フェローシップ BPF-144483 健康の研究のカナダの協会からサポートされていました。T. s. は受信者のカナダ大学院奨学金修士賞および健康の研究のカナダの協会からヴァニエ カナダ大学院奨学金。この仕事は、営業 PJT 148811 (j. p. j.) 健康の研究のカナダの協会からの助成金によって支えられました。一部では、カナダの研究の椅子プログラム(j. p. j.)からの資金のおかげで、この研究がうけた。
0.22 μm Steritop filter | EMD Millipore | SCGPS02RE | |
10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel | Bio-Rad | 4561084 | |
10x glycobuffer 3 | New England Biolabs | P0702S | Comes with Endo H reagent |
10x Kinetics Buffer | PALL FortéBio | 18-1092 | |
10x Tris/Glycine/SDS Buffer | Bio-Rad | 1610732 | |
1 mL round bottom 96 well block | ThermoFisher | 260251 | |
22 mm cover slip | Hampton research | HR3-231 | |
4x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610747 | |
96-3 well INTELLIPLATE low volume reservior | Art Robbins Instruments | 102-0001-03 | |
AgeI | New England Biolabs | R0552S | |
ÄKTA Pure | GE Healthcare | ||
ÄKTA Start | GE Healthcare | ||
Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO | Millipore | UFC901008 | |
Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO | Millipore | UFC801008 | |
Auto-iTC200 | Malvern | ||
Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes | Fisher Scientific | MCT150C | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm | Hampton research | HR4-945 | |
CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm | Hampton research | HR4-947 | |
CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm | Hampton research | HR4-970 | |
Digital Dry Bath | Bio-Rad | 1660562EDU | |
E. coli DH5α | Invitrogen | 18258012 | |
Endo H | New England Biolabs | P0702S | |
Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP | TriForest Labware | FBC05000S | |
Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap | VWR | 89095-258 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL | Greiner Bio-One | 607180 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL | Greiner Bio-One | 760180 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL | Greiner Bio-One | 606180 | |
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL | Greiner Bio-One | 768180 | |
FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus | VWR | 10118-842 | |
Freestyle 293F cells | Thermo Fisher Scientific | R79007 | |
Freestyle Expression medium | Thermo Fisher Scientific | 12338001 | |
Heavy Atom Screens Au | Hampton research | HR2-444 | |
Heavy Atom Screens Hg | Hampton research | HR2-446 | |
Heavy Atom Screens M1 | Hampton research | HR2-448 | |
Heavy Atom Screens M2 | Hampton research | HR2-450 | |
Heavy Atom Screens Pt | Hampton research | HR2-442 | |
HEK 293S | ATCC | ATCC CRL-3022 | |
HisTrap Affinity Column | GE Healthcare | 17525501 | |
HiTrap KappaSelect Affinity Columns | GE Healthcare | 17545811 | |
HiTrap LambdaSelect Affinity Columns | GE Healthcare | 17548211 | |
KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-1 | |
MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-2 | |
MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-3 | |
MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block | Anatrace | MCSG-4 | |
Mercuric chloride | Sigma | 1044170100 | |
Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black | Greiner Bio-One | 655209 | |
Minstrel DT UV | Formulatrix | ||
Multitron Pro shaker | Infors HT | MP25-TA-CO2HB | |
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | |
Nanosep 3K Omega centrifugal device | PALL Life Science | OD003C33 | |
Ni-NTA biosensors | PALL FortéBio | 18-5102 | |
Octet RED96 | PALL ForteBio | ||
Oryx 4 crystallizaiton robot | Douglas Instrument | ORY-4/1 | |
Platinum chloride | Sigma | 520632-1g | |
Precision Plus Protein Standard | Bio-Rad | 161-0374 | |
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Invitrogen | K210006 | |
Quick Coomassie Stain | Protein Ark | GEN-QC-STAIN-1L | |
Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 µm Millipore Express | EMD Millipore | SCGP00525 | |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | GE Healthcare | 28990944 | |
Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17517201 | |
Tantalum bromide cluster | Jena bioscience | PK-103 | |
Top96 Crystallization Screen | Rigaku Reagents | 1009846 | |
Tryphan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
VDX 24-well with sealant | Hampton research | HR3-172 | |
α2-6 sialyllactose | Sigma Aldrich | A8556-1mg |