Caracterização de Glicoproteínas com Dobra da Imunoglobulina por Cristalografia de Raios-X e Técnicas Biofísicas

1. construir o projeto para a glicoproteína ECD Avaliar a sequência de aminoácidos de CD22 humana (Uniprot) usando os servidores InterPro e Phyre2 para identificar elementos de domínio previsto e limites localizada dentro da proteína48,49. Clonar a sequência de CD22 humano, falta o peptídeo sinal, domínios transmembranares e citosólico (resíduos 20-687, doravante CD22 domínio extracelular, CD22 ECD) na pHLsec mamíferos expressão vetorial25 usando enzimas de restrição AgeI e KpnI ( Figura 2 ) 50.Nota: O vetor de pHLsec é otimizado para a superexpressão de proteínas solúveis, secretadas em células de mamíferos,25. Este vetor contém um sinal de secreção para permitir a secreção extracelular de glicoproteínas solúveis. pHLsec contém uma marca de6 x C-terminal (dele) para facilitar a purificação da afinidade de sobrenadantes de células usando os métodos de cromatografia de afinidade de metal imobilizado. Clonar construções truncadas de CD22 ECD com exclusões sequenciais dos domínios C-terminal Ig: 1-6 (20-687 resíduos) de domínios, domínios 1-5 (resíduos 20-592), domínios 1-4 (resíduos 20-504) e domínios 1-3 (resíduos 20-330) (figuras 2B e 2C)50 . Avalie a sequência primária de ECD CD22 usando o servidor de NetNGlyc para identificar sites de glicosilação previsto N-ligadas presentes na construção de51. Usando o mutagenesis local-dirigido, por protocolos padrão52 ou por sobreposição PCR53, mutar cada site previsto glycosylation N-ligadas (Asn para Gln e/ou Asn para Ala) para criar construções de ECD CD22 que contêm um único ou vários Mutações de N-ligadas glicosilação. Após verificação de sequência de construções clonadas, transformar em competentes de Escherichia coli DH5α células54 e maxipreparação do DNA (conforme as instruções do fabricante) para se preparar para transfeccao. 2. HEK293F e estabelecimento de célula HEK293S Nota: Toda a manipulação de células HEK293F ou HEK293S com os reagentes necessários e o equipamento devem ser realizado em uma instalação de nível 2 de biossegurança em uma armário de biossegurança adequada. A superfície externa de todos os itens deve ser esterilizada com uma solução de etanol 70% ou reagente equivalente. Obter células de suspensão de HEK293F e HEK293S (ver Tabela de materiais) e armazenar a-80 ° C até que esteja pronto para uso. Mídia quente (ver Tabela de materiais) por 1h em banho maria a 37 ° C. 24 mL de mídia aquecida de transferência para um balão de cultura celular perplexo 125 mL com tampa exalada. Obter célula 1ml alíquota de-80 ° C e transferência para o gelo. Incube as células em um banho de água de 37 ° C por cerca de 1 min, para descongelar parcialmente as células. Transferi 1 mL de células do frasco para o frasco de cultura de célula perplexo 125 mL contendo os meios de comunicação. Feche o frasco de cultura celular com a tampa exalada e lugar de balão em um shaker definido como 130 rpm, 37 ° C, umidade de 70% e 8% CO2. 3. HEK293 Cell manutenção Nota: A densidade celular e a viabilidade das células devem ser verificado aproximadamente 24 h após o descongelamento. Esta etapa garante que as células estão se recuperando após inoculação; viabilidade inicial deve ser > 80%. Cuidadosamente remova o frasco de 125 mL contendo as células frescas suspensão 10 µ l de células e transferi-lo para um microtubo estéril 1,5 mL. Feche o frasco e devolvê-lo para a incubadora. Pipetar 10 µ l de solução de azul de Trypan o microtubo de 1,5 mL contendo as células, homogeneizar e transferir 10 µ l para a câmara do slide contando. Coloque o slide contando em um contador automático de células e obter valores de densidade de pilha (em unidades de células mL-1) e viabilidade celular (em percentagem). Calcule o volume das células, o que seria necessário para inocular uma cultura fresca 200ml em uma densidade final de ~0.8 x 106 células mL-1 usando as seguintes equações:(1)(2)Nota: Pode levar ~ 5D para obter uma densidade celular adequada para inoculação de uma cultura de 200 mL. Uma vez que a densidade de células é suficiente para a inoculação de uma cultura de 200 mL, warm-up mídia por 1h em uma 37 ° C banho de água e transferir mídia aquecida para a armário de biossegurança. Usando uma pipeta sorológica, transferi com cuidado o volume necessário de mídia (como calculado na equação 2) para um balão de cultura de célula perplexo de 500 mL com tampa exalada. Usando uma pipeta sorológica, transferi o volume necessário de células de suspensão (calculado na equação 1) para o frasco de cultura de célula perplexo 500 mL contendo os meios de comunicação. O novo estoque de manutenção de 200 mL do tampão e devolvê-lo para a incubadora. Desenvolvem-se células para uma densidade de aproximadamente 3 x 106 células mL-1. Passagem de células em uma densidade de 0,8 x 106 células mL-1 cada 2-3 d para manter uma cultura estável de células (conforme descrito na seção 3.4-3.7). Não permita que as células exceder uma densidade de ~ 4 x 106 células mL-1. 4. transfecção de células HEK293 para expressão da glicoproteína Calcular o volume das células e a mídia que é necessária para uma cultura de 200ml para transfeccao em 0,8 x 106 células mL-1 (usando equações 1 e 2 da seção 3.4).Nota: O número de transfections de 200ml que podem ser executadas depende da densidade de células da unidade populacional de manutenção. Transferir o volume necessário de mídia e células para transfeccao para um novo balão de cultura celular de 500 mL, com uma tampa exalada e retornar o estoque de célula para a incubadora. Incube células por 1h antes de Transfeccao para permitir que células se adapte dividindo a seguir. Transferir 50 µ g de DNA em um tubo cônico estéril 50 mL e diluir com 5 mL de mídia. O DNA diluído, usando um sistema de filtragem de 0,22 µm em outro tubo estéril de filtro de vácuo. Mistura diluída, filtrado DNA em uma relação de massa: volume 1:1 com reagente de transfeccao. Agite suavemente a solução reagente de Transfeccao de DNA: para misturar e incubar a solução à temperatura ambiente por 10 min. Adicione solução de reagente de transfeccao: DNA diretamente para as células. Incube as células transfectadas em 130 rpm, 37 ° C, umidade de 70% e 8% CO2 em uma coqueteleira para 5-7 d. 5. otimização das condições de transfecção celular Nota: Para otimizar as condições de transfecção celular para rendimento máximo glicoproteína, transfect células em uma variedade de densidades de pilha inicial e avaliar o rendimento de proteína ao longo do tempo(Figura 3). Transfect células conforme descrito na seção 4, em densidades de pilha inicial variando de 0,5 x 106 a 2 x 106 células mL-1 55. Transfections julgamento podem ser escalados para baixo para o volume total de 25 mL (no frasco de cultura de células perplexo 125 mL) com 6 µ g de DNA para economizar espaço e reagentes. A quantidade de DNA também pode ser otimizado55. Cada pós-transfeccao dia (dias 1-7), transferir uma alíquota de 500 µ l de cultura de pilha em um microtubo estéril 1,5 mL (no gabinete de segurança biológica). Gire as células aliquotadas a 12.000 x g por 5 min numa microcentrifuga imediatamente após a colheita. Transferi o sobrenadante para um novo microtubo de 1,5 mL e loja a 4 ° C, até que todas as amostras são obtidas. Dosar a glicoproteína secretada por densitometria Uma vez que todas as amostras são obtidas, alíquota 20 µ l de cada amostra para um novo microtubo de 1,5 mL e misture com 6 µ l de não-redução 4 x Laemmli amortecedor da amostra. Ferva amostras por 5 min a 95 ° C, em um bloco de thermo. Amostras para 1 min a 12.000 x g numa microcentrifuga de girar. Carrega a 20 µ l de cada amostra por bem em um gel de SDS-PAGE 10-poço 4-15% gradiente. Inclua uma pista para os marcadores de tamanho da proteína. Funcione o gel em 250 V por 20 min em um tampão Tris/glicina/SDS. Após conclusão de execução, transferir gel de Coomassie mancha (ver Tabela de materiais) por 20 min. de manchar o gel em ddH2O por 20 min. gel de imagem. Realize densitometria com ImageJ, seguindo protocolos padrão57,58. Compilar e plotar dados com ‘do pós-transfection dias’ no eixo x e ‘densitometria valores’ no eixo y(Figura 3).Nota: Como alternativa, se a expressão de proteínas é insuficiente para visualização por SDS-PAGE, técnicas como a mancha ocidental podem ser usado56. Dosar a glicoproteína secretada por BLI Usando biosensores Ni-NTA, dose a quantidade de glicoproteína secretada usando BLI59. Compilar e plotar dados com ‘do pós-transfection dias’ no eixo x e ‘proteína concentração (µ g/mL)’ no eixo y(Figura 3). 6. purificação de glicoproteína solúvel de sobrenadante HEK293 Colheita de células por centrifugação a 6.371 x g por 20 min a 4 ° C. Reter o sobrenadante contendo secretada CD22 ECD e filtrar usando um filtro de 0,22 µm. Carregar o sobrenadante em 4 mL min-1 em um pre-equilibrada coluna do Ni-NTA de (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, imidazol 5mm) (volume de 5 mL) usando um sistema de cromatografia de bancada.Nota: Outras técnicas de purificação baseada na afinidade podem ser utilizadas, com base a afinidade Tags incluído no projeto de construção na secção 1. Após o carregamento do sobrenadante, lavar a coluna de afinidade com 3-4 volumes de coluna (CV) de tampão de lavagem (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, imidazol 5 mM). Eluir glicoproteína purificada da coluna usando um gradiente de 4-100% (4 CVs) do tampão de eluição (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, imidazol 500mm) ao coletar frações (Figura 3B). Fracções de piscina contendo o pico eluted em um dispositivo de filtragem centrífuga com um limite de peso molecular nominal kDa (NMWL) 10 e concentrado por centrifugação a 4.000 x g a 4 ° C por 15 min ou até que a amostra atinja um volume de 500 µ l. Injetar glicoproteína concentrada em um 500 µ l amostra loop e carga em 0,5 mL min-1 para uma pre-equilibrada (20 mM Tris, pH 9.0, 150 mM NaCl) coluna de exclusão de alto desempenho tamanho (aproximadamente o volume de 24 mL) em uma cromatografia líquida de proteína rápida (FPLC) sistema a 4 ° C, enquanto que coletando frações (Figura 3C). Funcione o gel de SDS-PAGE de frações eluted para identificar frações que contêm a glicoproteína e piscina fracções correspondentes. O gel de SDS-PAGE pode ser executado como descrito na seção 560. 7. Deglycosylation da glicoproteína purificada Medir a concentração de proteína purificada após cromatografia de exclusão por meio de absorbância em 280 nm dividido pelo coeficiente de extinção (por exemplo, 1,418 M-1 cm-1 para CD22 ECD).Nota: O coeficiente de extinção teórica das proteínas de interesse pode ser calculado usando servidores como ExPASy ProtParam61. Incube a proteína purificada com Endo H para 1 h a 37 ° C, na proporção de 1 mg de proteína purificada a 10 µ l da enzima comercial em 1 buffer X Endo H (conforme as instruções do fabricante).Nota: Endo H cliva manose alta os glicanos produzidos em HEK293S, deixando um único GlcNAc moiety em cada local de glicosilação21. Endo H não decompor os glicanos em proteínas produzidas em células de HEK293F22, porém outras enzimas podem ser usadas para esta finalidade (por exemplo,PNGaseF,24). Concentre-se deglycosylated ECD a 500 µ l e executar cromatografia de gel filtração em uma coluna de exclusão de alto desempenho tamanho (aproximadamente o volume de 24 mL) em 0,5 mL min-1 em um FPLC remover Endo H e separar qualquer agregados resultantes. Armazene a proteína de deglycosylated a 4 ° C até o uso em experimentos a jusante. 8. a cristalização de glicoproteínas Nota: Realizar ensaios de cristalização usando telas disponíveis comercialmente e configurar sentado gota experimentos usando um robô de cristalização. Concentrado puro, deglycosylated ECD para 10 mg mL-1 , usando um dispositivo de filtragem centrífuga com kDa 10 NMWL a 4.000 x g (4 ° C) até a concentração desejada é obtida. Determinar a concentração de proteínas por meio de absorbância em 280 nm e dividindo pelo coeficiente de extinção. Amostra de centrifugação a 12.000 x g por 5 min a 4 ° C antes de ensaios de cristalização para remover indesejados de poeira ou outros contaminantes da amostra. Encha o reservatório de poços da sessão de 96 poços soltar placas de cristalização com 80 µ l de solução de cristalização de uma tela de cristalização comercial.Nota: Usamos a matriz esparsa telas comerciais que foram projetadas baseadas sobre as condições de cristalização mais bem sucedidas no que diz respeito a estruturas depositadas no PDB. Usando um robô de cristalização, dispense gotas dentro do poço da placa de cristalização, com um volume total de gota de 200 nL em uma proporção de solução de proteína purificada: cristalização de 1:1. Uma vez que o prato inteiro tem sido dispensado, sele a placa com fita e coloque em um tonalizador de placa para inspeção por luz visível e ultravioleta. Inspecione placas de cristalização imediatamente após a instalação e nas semanas seguintes, usando a luz visível e ultravioleta para identificar condições que deu glicoproteína inicial cristal hits. Otimize ainda mais os cristais obtidos de sucessos iniciais cristalização usando telas finas, baseadas na condição do sucesso de cristal ou aleatório matriz microsemeadura métodos62,63,64,65. Cryo-proteger os cristais falta cryo-protetor suficiente dentro da condição de cristalização embebendo o cristal em mãe licor suplementada com solução de glicerol 20% (v/v) de solução (ou equivalente de cryo-protetor, tais como o glicol de etileno ou polietileno glicol 400). Cristais de montagem em cryoloops e flash congelá-los em nitrogênio líquido antes da coleta de dados em um fonte em casa difratômetro ou usando radiação síncrotron. 9. eliminação usando o átomo pesado derivatização Nota: Antes de qualquer manipulação de compostos HA, aspectos de segurança devem ser considerados. HA compostos usados em cristalografia de proteínas são selecionados pela sua forte afinidade de moléculas biológicas e representam riscos para a saúde humana da exposição prolongada. Tome medidas de segurança adequadas para compostos HA como mencionado em seu Material Safety Data Sheets. Para testar diferentes compostos HA, concentrações e tempos de incubação, reproduzem bem diffracting cristais obtidos na secção 8 em uma placa de 24 poços cristalização usando o enforcamento soltar vapor difusão método66. Decidir qual HA será usado para derivatização de cristal. Servidores (por exemplo, o átomo pesado sistema de banco de dados67) podem ajudar com seleção composta HA, assegurando que são adequados para a condição de proteína e cristalização.Nota: HA telas também são comercialmente disponíveis para a seleção fácil de compostos HA mais eficazes para a eliminação. Um conjunto de “magia sete” HA compostos têm sido descritos anteriormente para ter alta probabilidade de sucesso para HA derivatização68. Configurar a estação de trabalho para HA imersão(Figura 4). Usando um cryoloop, transferência rápida cristais para um 0,2 µ l cair sobre uma lamela de 22 mm, contendo HA solução diluída na condição de cristalização, tal que a concentração final de HA varia de 1 a 20 mM. A entrega do selo e incubar durante diferentes períodos de tempo (Figura 4B). Um bom ponto de partida é a 5, 10, 60 e 90 min e durante a noite. Inspecione visualmente os cristais com um microscópio de luz para identificar possíveis fissuras ou alterações na cor, que pode indicar os efeitos adversos para a glicoproteína cristal ou derivatização de cristal. Montagem de cristais em cryoloops e cristais de banho de costas por 30 s em µ l de 0.2 consecutivos três gotas contendo solução de licor mãe suplementada com 20% (v/v) glicerol (ou alternativo cryo-protetor)69. Imersão de volta os cristais remove HA composto que foi vinculado não especìfica e reduz a ocupação parcial, causada pela fraca ligação de HA. Flash cristais de congelamento em nitrogênio líquido (Figura 4B). Para a coleta de dados, processamento, solução de estrutura e requinte, use protocolos descrito anteriormente26,70,,71,72. 10. glicoproteína cristais com seu ligante de imersão Se reproduzem bem diffracting cristais obtidos na secção 8 em uma placa de cristalização 24-bem usando o método de difusão de vapor de enforcamento-gota. Prepare uma solução stock de ligante de 50mm em 20 mM Tris, pH 9.0, 150 mM de NaCl.Nota: A concentração do ligante deve ser preparada de acordo com a afinidade de sua glicoproteína. Se a afinidade é desconhecida, talvez seja necessário usar um método como ITC (seção 12.2) para determinar a afinidade antes do início de experiências de imersão. Certifique-se que o ligante é solúvel na concentração desejada no buffer necessário. Adicionar diferentes concentrações do ligante para os gota contendo cristais ECD e selar a gota para incubação em comprimentos de tempo que variam entre 5 min para 5D. Controle visualmente cristais com um microscópio de luz para identificar possíveis alterações na morfologia. Montagem de cristais em cryoloops e crio-protegê-los em solução de licor mãe suplementada com 20% (v/v) glicerol (ou outro cryo-protetor como glicol de etileno ou de baixo peso molecular polietileno glicol 400)69. Para coleta de dados, processamento, solução de estrutura e requinte, use protocolos descrito anteriormente73,,74,75. 11. produção de fragmento do antígeno (Fab) de vinculação Subclone genes que correspondem a sequências de cadeia leve (LC) de anticorpos anti-ECD, por exemplo,o epratuzumab e Fab cadeia pesada (HC).Nota: Como alternativa, IgG pode ser clivada pela papaína enzima para gerar fragmentos Fab76. Transfect células conforme descrito na seção 4, com as seguintes modificações: Use uma massa total de DNA para transfeccao de fragmentos Fab de 90 µ g / 200 mL de cultura. Transfect HC e LC plasmídeos na proporção de 2:1 para reduzir a quantidade de formação de dímero de LC. Após 7 d de incubação, colher células, reter o sobrenadante e filtrar com um dispositivo de vácuo controlado por filtração de 0,22 µm. Equilibrar colunas de afinidade (kappa ou lambda) anti-LC em tampão PBS, usando um sistema de cromatografia de bancada.Nota: Se a formação do dímero de LC é um problema durante a purificação, a cromatografia de afinidade da proteína G pode ser usada como uma alternativa para a purificação da afinidade do kappa/lambda LC. Carregar o sobrenadante na coluna de afinidade em 4 mL min-1. Após o carregamento de amostra, lave a coluna com 3-4 CVs de PBS. Eluir a proteína da coluna usando uma eluição isocrática com glicina de 100 mM, pH 2.2, imediatamente, neutralizando as frações eluted com 10% (v/v) 1 M Tris, pH 9.0 em cada fração.Nota: O Fab eluted pode ser mais purificado por cromatografia de troca iônica e/ou cromatografia de exclusão usando um FPLC a 4 ° C. 12. Caracterização da Fab e pequena molécula vinculativos para a glicoproteína Interferometria de Biolayer Prepare 50 mL de tampão de cinética (1X PBS, 0,002% (v/v) Tween-20, 0,01% (p/v) BSA) 1x. Hidrate seis biosensores Ni-NTA em 200 µ l de debuffer 1 x cinética durante 10 minutos em um prato de pre-umectante. Dilua com sua tag ECD em 1 mL de tampão de cinética 1 x em uma concentração final de 25 µ l de ng-1. Pipetar diluições em série de Fab purificada em 200 µ l de tampão de cinética, 1x com uma alta concentração de 500 nM e as diluições de série subsequentes de 250 nM, 125 nM e 62.5 nM. Alíquotas reagentes em polipropileno microplacas de 96 poços fundo plano preto como mostrado na Figura 5A, onde cada um bem contém 200 µ l da solução indicada. Colete dados usando a ensaios de cinética do software de aquisição de dados, conforme descrito anteriormente,38,39,77 (Figura 5A). Brevemente, transferir os biossensores para poços contendo tampão de cinética de linha de base para 60 1x s antes de carregar 25 ng µ l-1 de glicoproteína para 240 s (ou até um limite de 1.0 nm é alcançado) a 1.000 rpm. Depois de uma segunda linha de base de 60 s em tampão de cinética, 1x transferir os biossensores para poços contendo a diluição serial de Fab. A fase de associação 180 s é posteriormente seguido por uma etapa de dissociação s 180 em cinética tampão 1x.Nota: Biossensores podem ser reutilizados se o protocolo acima é seguido por uma etapa de regeneração, que consiste em três ciclos de lavagem as biosensores no descascamento tampão (PBS com imidazol 500 mM) para 5 s seguido por 5 s no buffer de cinética para neutralização de 1x. Biosensores podem ser reutilizados até ~ 10-20 vezes durante o mesmo dia, ou até dados pobres qualidade é observada. Analise os dados usando o software de análise (Figura 5A): Sob a aba 1, importação e selecionados dados. Sob a aba 2, etapa 1: Seleção de dados, selecione ‘Seleção de Sensor’ e poços de referência de destaque (linhas E e F, Figura 5A), clique direito e conjunto para referenciar o bem. Em etapa 2: Subtração, selecione ‘referência Wells’. Em etapa 3: Alinhar o eixo y, selecione ‘Base’ do intervalo de tempo de 0.1 a 59,8 s. Em etapa 4: Etapa inter correção, selecione ” Alinhar à dissociação’. Em etapa 5: Processo, selecione ‘Savitzky-Golay filtragem’ e imprensa dados de processo. Em 3 de guia, selecione ‘Associação e dissociação’ sob passo a analisar com um modelo de 1:1. Selecione ‘Global adequado’ e ‘Grupo de cor’. Curvas com o botão direito, selecione ‘Mudar de cor’, defina todas as curvas para a cor de sua escolha. Selecione ‘Ajustar curvas’. Se os dados estão bem equipados, um relatório pode ser exportado, selecionando “Salvar relatório”. Repita a experiência com glicoproteína produzida em células HEK293F e HEK293S (seção 5) e após o tratamento Endo H (secção 7) para avaliar o efeito, se for o caso, de diferentes glycoforms na Fab reconhecimento. Além disso, repeti o experimento com truncamentos de ECD de fornecer informações sobre o domínio (s) vinculado o Fab. Calorimetria de titulação isotérmica de interação de Fab-glicoproteínaNota: Experiências ITC descritas aqui são executadas usando um instrumento automatizado de ITC. Experimentos são realizados em um 1ml por bloco de 96 poços de fundo. Dialize o ECD e Fab num único copo 4L de 20 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl a 4 ° C durante a noite com uma barra de agitação. Concentre-se dializados ECD e Fab 5 µM e 50 µM, respectivamente, usando um filtro centrífugo com kDa 10 NMWL, garantindo para lavar três vezes com 5 mL de diálise, as membranas do concentrador de buffer a 4.000 x g durante 5 min à 4 ° C antes de usar.Nota: Qualquer incompatibilidade em buffer entre amostras na célula e seringa pode causar calor indesejado ser lançado durante o experimento ITC e resultam em dados de má qualidade. Para o experimento 1: adicionar 400 µ l de ECD para A1 para ser carregado na célula e 120 µ l do Fab para A2 bem para ser carregado na seringa. Bem A3 é deixado vazio para retornar a seguinte amostra mista experimentar a conclusão. Cada experimento subsequente pode ser adicionado ao prato na mesma ordem (ou seja, experimento 2: bem vazia de celular – A4, seringa – A5 – A6; Figura 5 B).Nota: Incluir o buffer em controles de reserva (para confirmar que o instrumento está se comportando bem) no início e no final de cada corrida, bem como ligante (na seringa) em controles de buffer (no celular) para calcular o calor de diluição para a amostra na seringa. Este calculado calor de diluição deve então ser subtraída dados experimentais brutos durante a análise de dados (Figura 5B). Execute um total de 16 injeções com um volume de 2,5 μL de cada injeção. A duração da injeção é 5 s, com espaçamento de s 180 entre as injeções. Definir a temperatura de célula de 25 ° C, com uma velocidade de agita de 750 rpm e um período de filtro de 5 s.Nota: Com base na afinidade e termodinâmica da interação ECD:Fab, pode ser necessário alterar a concentração de amostra, o número de injeções ou temperatura da célula. Analise os dados com o software de análise, conforme descrito anteriormente,40,41,43 (Figura 5B). Repeti a experiência, pelo menos em duplicatas, calcular valores de KD e erros-padrão. Repeti a experiência com ECD de diferentes glycoforms (seções 5 e 6) para avaliar o efeito, se for o caso, de glycoforms sobre a termodinâmica da interação Fab: glicoproteína. Por calorimetria de titulação isotérmica de interações ligante-glicoproteína, configure o experimento ITC, conforme descrito na seção 12.2, com as seguintes alterações: Dialize ECD em 4 L de tampão de diálise durante a noite. Dissolva o ligante usando buffer de diálise após a conclusão da diálise. Realize experimentos ITC em concentrações significativamente maiores para ser capaz de detectar interações de baixa afinidade. Para a interação ECD e ligante, realizar experiências ITC em concentrações de 100 µM do ECD na célula e 1 mM de ligante na seringa.