Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Melike Cokol-Cakmak; Feray Bakan; Selim Cetiner; Murat Cokol

doi:10.3791/57713

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biyoloji

Ölçü sinerji arasında pek çok uyuşturucu için köşegen yöntemi

Published: June 21, 2018

doi:

10.3791/57713

Melike Cokol-Cakmak¹, Feray Bakan², Selim Cetiner¹, Murat Cokol^1,2,3

¹Faculty of Engineering and Natural Sciences,Sabanci University, ²Nanotechnology Research and Application Center,Sabanci University, ³Laboratory of Systems Pharmacology,Harvard Tıp Fakültesi

Özet

Bu protokol için Loewe additivity tabanlı ilaç etkileşimi ölçümleri yapmak ikili ve üçlü ilaç kombinasyonlarını anlatan.

Abstract

Bir sinerjik uyuşturucu arada bireysel ilaçların etkileri karşılaştırıldığında daha yüksek bir etkinlik var. Dama tahtası deneyleri, nerede uyuşturucu birçok dozlarda birleştirilir, ilaç etkileşimleri, hassas ölçüm sağlar. Ancak, bu deneyleri maliyetlidir ve de birçok ilaç arasında etkileşim ölçmek için ölçek mi. Birkaç son yıllarda yapılan çalışmalarda geleneksel dama tahtası tahlil çapraz bir örnekleme kullanarak ilaç etkileşimi ölçüleri bildirdin. Bu alternatif yöntemi büyük ölçüde ilaç etkileşimi deneyler maliyetini azaltır ve etkileşim ölçüm birleşimleri olan birçok ilaç için sağlar. Burada, biz sadece üç 96-şey Mikroplaka ve standart Laboratuar donanımları kullanarak üç ikili etkileşimleri ve yinelenen, üç antibiyotik arasında beş günde bir üç yönlü etkileşim ölçmek için bir protokol tanımlamak. Levofloksasin + Nalidixic asit + penisilin G üç antibiyotik kombinasyonu sinerjik olduğunu gösteren temsilcisi workshop’larda. Bizim iletişim kuralı etkileşimleri arasında birçok ilaç ve çoklu ilaç sinerji patojenler ve tümörler karşı için verimli ekranlar için izin diğer biyolojik bağlamlarda ölçmek için ölçekler.

Introduction

Uyuşturucu kombinasyonları bir fenotip sinerjik ya da antagonist ilaç etkileşimleri, sırasıyla¹^,²^,³için karşılık gelen kurucu ilaçların etkileri göz önüne alındığında şaşırtıcı derecede yüksek veya düşük etkisi sergileyebilirler. Sinerjik kombinasyonları kullanımı doz-yükseltme etkinliğini artırmak için ve doz azaltma yan etkisi yardım için izin verebilir. Kombinasyon tedavileri de birden fazla aksiliklere hücresel makine, böylece olası evrimsel kaçış mekanizmaları direnci⁴engelleme için geçerli olabilir. Bu nedenle, üç veya daha fazla ilaç bileşimleri rutin patojen veya kanser tedavi⁵‘ te kullanılır.

Sinerji ve düşmanlık bir arada bireysel uyuşturucu etkileri göz önüne alındığında beklenen etkisi karşı gözlenen etkisi arasında bir karşılaştırma tarafından tanımlanır. İlaç etkileşimleri modellerinde arasında Loewe additivity en sıkı ve iyi tanımlanmış bir boş modeli ()Şekil 1)⁶ve inferred sinerji/husumet etkileşim kullanılan ilaç konsantrasyonu bağımsızdır ⁶ ^, ⁷. ancak, Loewe modeli deneysel olarak bile ikili etkileşim sınava maliyetlidir. İlaç etkileşimi deneyleri geleneksel ilaç konsantrasyonu kombinasyonları (dama tahtası tahlil) 2D bir matris oluşturan ()Şekil 2). 5 doz her ilaç için kullanılır, daha sonra 25 kombinasyonları gereklidir, birine karşılık gelen bir Mikroplaka çoğaltıldıktan deneyler yaptı Eğer yarısı. Bu yaklaşım maliyetini sinerji ölçüm Loewe additivity modeli çoklu ilaç kombinasyonunun ()Şekil 3)tarafından yasaklar. Örneğin, 10 yönlü etkileşim sınamak için geleneksel yöntemler gerektirir 100 binden fazla Mikroplaka, deneysel yüksek sıralı sinerji ölçümü sıkı, iyi theorized ve konsantrasyon bağımsız Loewe additivity modeli tarafından engelleme ⁸.

Mevcut klinik tedaviler uyuşturucu kombinasyonları yalnızca bir kısmını kullanır. Örneğin, standart aktif Tüberküloz tedavisinde üç antibiyotik kombinasyonudur. Orada yaklaşık 20 antibiyotik Mycobacterium tüberküloz (Mtb) tedavisinde kullanılan. 1140 3’lü kombinasyonları arasında 20 uyuşturucu, her biri Mtbkarşı güçlü bir sinerji var için potansiyel vardır. İlaç etkileşimleri arasında birçok ilaç ölçmek için düşük maliyetli bir yöntem yoktur oldu gibi potansiyel olarak hayat kurtaran sinerjik kombinasyonları denenmemiş kalır.

Burada, sadece bir dama tahtası tahlil ()Şekil 4 çapraz örnekleyerek ikili ve üçlü ilaç etkileşimleri ölçmek için basit bir protokol tanımlayan ve Şekil 5). Bir dama tahtası deneme diyagonal örnekleme temel kavramı Berenbaum tarafından 1978⁹seminal işinde teorisini. Ancak, bu yaklaşım yakın zamanda uyuşturucu sinerji ekranlar¹⁰^,¹¹^,¹²‘ ye uygulanmıştır. Biz bizim protokolü ile mevcut Escherichia coli (e.coli) ve büyüme fenotip. Ancak, protokol biyolojik türler ve fenotip ilgi bağımsızdır ve bu nedenle yüksek sıralı uyuşturucu sinerji biyolojik diğer bağlamlarda ölçümü için uygulanabilir unutmayın.

Protocol

Not: E. coli bakteri büyümesini engeller herhangi bir küçük molekül için köşegen yöntemi kullanılabilir. Beri bu ilaçların en göze çarpan bir üçlü sinerji göstermek bu protokol için Levofloksasin (LEV), nalidixic asit (NAL) ve penisilin G (PNG) bir örnek olarak kullanılır. İş akışını bu protokolü ve Şekil 6gösterilir. Oda sıcaklığında tüm adımları uygulayın. Bakteri ve uyuşturucu taze aliquots her gün kullanın. Biyogüvenlik düzeyleri E. coliiçin uygun deneme gerçekleştirin. 1. hazırlık adımları 25 g LB suyu 1 litre saf su ekleyerek Luria-Bertani (LB) ortam hazırlamak ve karıştırın. Basınçlı kap 15dk ve mağaza oda sıcaklığında autoclaved medya için 121 ° C’de. E. coli gliserol stokları steril % 50 gliserol ve bakteri hücreleri OD600 seyreltilmiş eşit miktarda karıştırılarak hazırlamak = 1 LB suyu ve 150 µL aliquots 1.5 mL microcentrifuge tüpler-80 ° C’de dondurmak 20 mg antibiyotik, LEV, NAL ve PNG dimetil sülfoksit (DMSO) her 1 ml geçiyoruz. LEV çözüm 100 x 0.2 µg/ml LEV çözüm 10 µL DMSO 990 µL ile karıştırılarak sulandırmak. 0.2 mg/mL LEV ve 20 mg/mL NAL ve PNG devam etmeden adımları kullanın. Her antibiyotik 1.5 mL microcentrifuge tüpler ve donma-20 ° C’de aliquot 50 µL E. coli almak bir 150 µL aliquot üzerinden-80 ° C. Tezcan. E. coli gliserol stokunun 100 µL 5 mL LB medya 14 mL kültür tüp içinde de ekleyin. Tüpler 37 ° C kuluçka gecede 200 devirde sallamak. 2. seri seyreltme doz-yanıt deney -20 ° c LEV, NAL ve PNG ilaçların bir aliquot al, onları çözme ve bu ilaçların seri dilutions için hazırlamak 10 dakika oda sıcaklığında bırak. 1100 µL LB medya 990 µL karıştırma tarafından LB – sol ve solvent (DMSO) 110 µL hazırlamak. LB – LEV LB medya 450 µL karıştırma tarafından 500 µL ve LEV 50 µL hazırlamak. Girdap LB – sol için 5 s en yüksek ayarda. LB – sol 20 µL 96-şey Mikroplaka wells ilk dört satırı ekleyin. Girdap 5 LEV’i LB – s en yüksek ayarda. İlk satır A. kuyuda LB – LEV 20 µL eklemek İki kat seri seyreltme LB – LEV için yukarı ve aşağı beş kez pipetting ikinci de ekleyerek ilk kuyudan 20 µL alarak hazırlamak. Bu iyi, 40 µL (Şekil 7A) ile biter 11 kadar tüm kuyular için sırayla yineleyin. Kaldırmak ve bir micropipette kullanarak, içerik 11 den 20 µL atın. 2.3-2.7 NAL ve PNG Mikroplaka, ikinci ve üçüncü satır sırasıyla kullanarak uyuşturucu için yineleyin. Bir iç pozitif kontrol dördüncü satırda tekrar uyuşturucu LEV için 2,3-2.7 adımları yineleyin. Bir spektrofotometre kullanarak ölçmek bir 1:10 OD600 seyreltme Kültür (adım 1.5-1.7). 5 mL LB medyaya için 0.01 OD600 de hücrelerde sulandırmak. Bir rezervuar dökün. Çok kanallı bir micropipette kullanarak, seyreltilmiş hücre 80 µL 2.4-2,9 adımda hazırlanan ilaç seri dilutions ekleyin. Her şey son uyuşturucu konsantrasyonlarda Şekil 7Aiçinde gösterilir. Buharlaşma önlemek için plaka mühür. 16 h 37 ° C’de plaka kuluçkaya (Tekrar adımları 1.5-1.7) 3. adımda kullanmak için yeni bir bakteri kültürü başlatın. 3. doğrusal seyreltme doz-yanıt deney OD600 absorbans için seri seyreltme doz-yanıt plaka adım 2 plaka okuyucu (Şekil 7A değil) kullanarak ölçmek ve sonuçları için aşağıdaki adımları göre yorumlayabilir. Büyüme her şey büyüme her satır için hiçbir ilaç kontrolü büyüme ile bölerek normalize ve OD600uyuşturucu durumda normalleştirme tarafından yüzde büyüme hesaplamak. Her ilaç için turuncu Şekil 7A doğrugösterilen ~ Büyüme inhibisyon (IC50), var wells bulun. Bu Wells konsantrasyon “seri IC50” her ilaç için olarak atayın. Taze uyuşturucu aliquots tezcan, LB medya ve çözücü (DMSO) 9:1 oranı ve LB-% 10 ilaç LB medya ve uyuşturucu LB medya eklemeden önce ilacın konsantrasyonu her ilacın seri IC50 100 x nerede 9:1 oranında, karıştırarak karışımı ile 1 mL LB – sol hazırlamak , 3.3 adımda seçilen. 11 konsantrasyonlarda LEV, NAL ve PNG ilaçların sürekli artan dozlarda LB-% 10 ilaç ve Şekil 7Biçinde gösterilen birimleri LB – sol karıştırarak hazırlayın. LEV doğrusal olarak artan dozlarda dördüncü satırda bir iç pozitif kontrol hazırlayın. 1:10 OD600 ölçmek seyreltme kültür adım 2,14 başladı. 5 mL LB medyaya için 0.01 OD600 de hücrelerde sulandırmak. Bir rezervuar dökün. 80 µL üstünde-e doğru çok kanallı bir micropipette kullanarak 3.6 adımda hazırlanan ilaç doğrusal dilutions seyreltilmiş hücrelerin ekleyin. Her şey son uyuşturucu konsantrasyonlarda Şekil 7Biçinde gösterilir.Not: Bu ilaç için seri IC50 doz-yanıt de ortada alırsınız. Buharlaşma önlemek için plaka mühür. 16 h 37 ° C’de plaka kuluçkaya (Tekrar adımları 1.5-1.7) 4. adımda kullanmak için iki taze bakteri kültürleri başlatın. 4. çapraz ilaç etkileşim deney OD600 absorbans doğrusal seyreltme doz-yanıtından adım 3 (Şekil 7B) için ölçmek. Her ilaç için IC50 içinde sonuçlandı ve hazırlamak konsantrasyon ilaç LEV, NAL ve PNG 100 x IC50 konsantrasyonlarda seçin. Taze uyuşturucu çözülme, 100 hazırlamak x IC50 her biri için ilaç ve 1:1 ilaç karışımları LEV + NAL, LEV + PNG ve NAL + PNG ve 1 hacimce hazırlamak: 1:1 ilaç karışımı LEV + NAL + PNG hacmen. İki tabak Şekil 8′ de gösterildiği gibi ilaç etkileşimi deneyler için hazır olun. 1:10 OD600 ölçmek seyreltme kültürlerin adım 3.11 başladı. OD600 hazırlamak iki 10 mL LB medyanın iki kültürler 0,01 dilutions =. 80 µL hücre kültürü 1 ve 2 plakaları 1 ve 2, sırasıyla ekleyin. Buharlaşma önlemek için plakalarının. Plakalar için 16 h 37 ° C’de kuluçkaya 5. çapraz ilaç etkileşimi puanları Ölçü OD600 absorbans çapraz ilaç etkileşimi için adım 4 tabak denemeler yapın. Büyüme her şey büyüme uyuşturucu kontrol her satır için de büyüme ile bölerek normalize. Her satır için sütun Büyüme inhibisyon gösterilen Şekil 8 turuncu doğru IC50 için en yakın olan bulun. Bu iyi uyuşturucu göreli yoğunlaşmasını dayalı IC50 atayın. LEV + NAL, LEV + PNG ve NAL + PNG ve LEV + NAL + PNG doz-yanıt için beklenen IC50 her birlikte tek ilaçların IC50 sayı ortalaması alınarak hesaplamak. Ortalama tam beklenen IC50 hesaplaması için basit bir yaklaşım12′ den önce açıklandığı gibi olduğunu unutmayın. Kesirli inhibitör konsantrasyon (FIC) puanları her birlikte beklenen IC50 tarafından gözlenen IC50 bölerek hesaplamak.

Representative Results

Daha önce üç uyuşturucu arasındaki ikili etkileşimler bildirdin: LEV, NAL ve PNG göre küçültülmüş dama tahtası deneyleri, nerede iki ilaç bir 4 x 4 Matriks13,14′ te kombine test üzerinde. NAL ve LEV sinerjik iken, PNG hem LEV NAL13,ve14ile uzlaşmaz olduğu bildirildi. Burada, bu ikili etkileşimler doğrulanmadı ve çapraz bir tahlil kullanarak bu üç ilaçlar arasında üç yönlü etkileşim ölçülür. Sonuçlarımız LEV + NAL + PNG sinerjik bir 3-yönlü antibiyotik kombinasyonu olduğunu ispat. Bireysel deneysel işlemin bölümleri sonuçları için şematik gösterimleri Şekil 7 sağ tarafında verildi ve Şekil 8. Burada, mevcut ve Şekil 9′ da verilen üç plaka okuma temsilcisi ham sonuçları yorumlamak. Üst plaka okuma seri ve doğrusal seyreltme denemeleri 2 ve 3 numaralı adımları yapılan karşılık gelir. Alt iki plaka okuma, adım 4’te yürütülen yinelenen etkileşim tabaklara. Şekil 9 ham veriler en iyi büyüme 0,55, ama medyanın kendisi, 0,05 optik yoğunluk var. OD600 itibaren yüksek ilaç konsantrasyonları içinde gözlemlediği gibi gösterir hiçbir büyüme olduğu. Bu nedenle, biz IC50 olarak tanımlar (0.55-0.05)/2 0.25 =. Her doz-yanıt için bu değere en yakın bulunan kuyu turuncu ile gösterilir. Þekil 9A üst yarısı adım 2, seri doz-yanıt deney sonuçlarını gösterir. LEV IC50 wells mı, 4 ng/mL için karşılık gelen sütun 10 iki çoğaltır. NAL ve PNG IC50 are 3 µg/mL ve 25 µg/mL, anılan sıraya göre. Bu konsantrasyonları Şekil 7Biçinde gösterilen 1 x konsantrasyon karşılık gelir. Şekil 9B alt yarısında adım 3, doğrusal doz-yanıt deneylerin sonuçlarını gösterir. LEV, NAL ve PNG’s IC50 0.4 0.8 x ve 1.2 bulundu x, anılan sıraya göre. Bu konsantrasyonları için adım 4 X IC50 1 olarak atanır. İki REPLICATE deneyler nerede IC50 Kuyu yapımı 9B şekiliçinde gösterilir karşılık gelen iki tabak turuncu ile gösterilir. Plaka 1, 1 x konsantrasyon onların IC50 tüm tek ilaçlar var. İkili veya Üçlü kombinasyon için beklenen IC50 tüm kombinasyonları da 1 x konsantrasyon için beklenen IC50 yapma kurucu uyuşturucu, aritmetik ortalamasının tarafından hesaplanır. Plaka 2, LEV ve PNG onların IC50 1 x konsantrasyon var, ama NAL IC50 1,2 x. Her birleşim için beklenen IC50, bu IC50 değerlerin aritmetik ortalamaları kullanılarak tanımlanır. Örneğin, 1.1 LEV + NAL ve NAL + PNG için beklenen IC50 olur x. İlaç etkileşimi (FIC) her kombinasyonu IC50 beklenen IC50 ile gözlenen plakaları sağ tarafında gösterildiği gibi bölünerek hesaplanır için puan. LEV + PNG ve NAL + PNG muhalif olmakla LEV + NAL ve LEV + NAL + PNG sinerjik, muayene iki tabak FIC puanları gösterir. İki tabak elde FIC puanları, protokol güvenilirliğini destekleyen aynı fikirdeyiz. Şekil 1: Null modeli tanım Loewe additivity ilaç etkileşimi modeli. İki 5 x 5 matrisler üzerinde bir Mikroplaka nerede uyuşturucu A doğrusal bir eksende solda gösterildiği gibi artar ve uyuşturucu en iyi bir konsantrasyon ölçülebilir fenotip (sağ üst) engeller. Bu matrisler ilavesi equipotent uyuşturucu çizgileri her tek ilaç konsantrasyonlarda uyuşturucu A. olarak aynı toplama olduğu ortada gösterilir Hücreler bu “dama tahtası” ilaç konsantrasyonu kombinasyonları üzerinde eklendiğinde, bu hat üzerinde kaydedilen fenotip bağladığı kuyular için eşdeğer olması beklenmektedir. Bu kendi kendine ilaç etkileşimi deneyde (kesikli yeşil çizgi ile gösterilen) bir fenotip tasvir eden isobole additivity boş modeli tanımlama doğrusal olması bekleniyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 2: Loewe additivity ilaç etkileşim modeline göre ikili ilaç etkileşimleri. Şekil1 bir dama tahtası tahlil iki ilaç birleştirildiğinde, gözlenen isophenotypic kontur düz, dışbükey veya içbükey olabilir. Sağda, mümkün isophenotypic kontür (kesik yeşil çizgiler) dama tahtası deneyleri üzerinde üst üste. Uyuşturucu kombinasyonları ile düz isophenotypic kontür vardır Loewe-katkı, kontür Loewe-katkı bir öz-self uyuşturucu müdahalesini farklı değildir olarak tanımı gereği. İsophenotypic dağılımı önemli ölçüde içbükey veya bombeli olduğunda sırasıyla sinerjik veya uzlaşmaz, oluşur. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 3: Üçlü ilaç etkileşimleri Loewe additivity ilaç etkileşim modeline göre. Dama tahtası tahlil ikili etkileşimleri için benzer, üç-uyuşturucu 3D bir kılavuzda (bir “checkercube”), nerede her uyuşturucu doğrusal bir eksende artırılır birleştirilir. Üç ilaçlar aynı olsa, isophenotypic yüzey additivity üç uyuşturucu kombinasyonları için tanımlama düz olması bekleniyor. Yüzey daha içbükey veya bu Loewe-katkı boş modeli daha bombeli ise, uyuşturucu kombinasyonları sinerjik veya uzlaşmaz, sırasıyla vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 4: ikili ilaç etkileşimleri ölçmek için köşegen yöntemi. Her dama tahtası tahlil için sadece kırmızı dikdörtgenler gösterilen bölgeleri ölçülür. ı ve II doğrusal olarak tek ilaç konsantrasyonu artmaktadır. III iki ilaç 1:1 karışımı ve tek bir ilaç olsaydı gibi doğrusal olarak bu karışımı titrating yaparak değerlendirilir. FIC gözlenen IC50 iki tek ilaç beklenen IC50 tarafından bölünmüş birlikte eşittir. Loewe additivity modeli için beklenen IC50 iki tek ilaç ortalama IC50 tarafından sonuna benzetilir. FIC değeri 1 Loewe-katkı çiftleri için ve daha düşük ya da sinerjik veya antagonistik çiftleri, sırasıyla2,12için 1’den daha yüksek. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 5: Üçlü ilaç etkileşimleri ölçmek için köşegen yöntemi. Her checkercube tahlil için sadece gösterilen bölgeleri ölçülür. ı, II ve III sürekli tek ilaç konsantrasyonları artan. IV 1 yaparak ölçülür: üç uyuşturucu ve tek bir ilaç sanki gibi doğrusal olarak bu karışımı titrating 1:1 karışımı. Kesirli inhibitör konsantrasyon için gözlenen IC50 3 tek ilaç verilen beklenen IC50 tarafından bölünmüş birlikte eşittir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 6: iş akışı için burada açıklanan köşegen yöntemi protokol ve her Mikroplaka için kurulum ayrıntılarını. Gün 4’te gösterilen plaka yinelenen içinde yürütülmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 7: seri ve doğrusal seyreltme doz-yanıt deneyler. Bir ilaç ve karşılık gelen son ilaç konsantrasyonları (A) hazırlık seri seyreltme doz-yanıt. E. coli hücreleri plakasına eklenir; büyüme için ertesi gün kullanımda doğrusal 16 h. seri IC50, turuncu renkte gösterilen her ilaç için seçildikten sonra kaydedilen seyreltme doz-yanıt deneyler. Bir ilaç ve karşılık gelen son ilaç konsantrasyonları (B) hazırlık doğrusal seyreltme doz-yanıt. E. coli hücreleri plakasına eklenir; büyüme 16 h sonra kaydedilir. Her ilaç için ertesi gün’ın kullanılacak seçili IC50s deneyler turuncu renkte gösterilir etkileşim uyuşturucu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 8: ilaç etkileşimi deneyler. Etkileşim deneyler hazırlıktır benzer tek ilaç doğrusal doz-yanıt, bunun dışında bir 1:1 veya 1:1:1 karışımı ilaçların iki için kullanılır veya üç doz-yanıt, sırasıyla uyuşturucu. Her doz-yanıt, turuncu, tasvir için IC50s gözlenen FIC puanlarını hesaplamak için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız. Şekil 9: temsilcisi deney sonuçları. Ana metinde sağlanan ayrıntıları ile açıklandığı protokolü kullanılarak elde temsilcisi sonuçları gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Uyuşturucu kombinasyonları patojenler veya tümörler karşı kurutma antibiyotik boru hattı koşullarda özellikle çekici bir umudu kullanmaktır. Ancak, bu potansiyel en az iki zorluklar engel oluyor. İlk zorluk olası kombinasyon astronomik sayısıdır. Örneğin, 100 antibiyotik arasında 4950 ikili kombinasyonları vardır. Tüm olası kombinasyonlar arasında 100 antibiyotik (2¹⁰⁰) yeryüzünde bakteri sayısı aynı büyüklük sırasında üzerinde olan (~ 10³⁰). Nasıl güçlü sinerjik kombinasyonları bu olanakları arasında tahmin çok sayıda hesaplama çalışma konusu olmuştur. İkinci zorluk yüksek sıralı ilaç etkileşimleri ölçümdür. Bir sayısal platform belirli bir 10-uyuşturucu arada bir bazı patojen karşı şiddetle sinerjik önerebilir miyim göz önünde bulundurun. İlaç etkileşimleri sınamak için geleneksel yöntemler doğrulayın veya bu hipotez çürütmek çok pahalı, bu nedenle birçok ilaç arasında sinerji çalışma bilimsel araştırma sınırları dışında olmuştur. Neredeyse 30 yıl önce ilk önerilmiş ve birkaç son sinerji ekranlarında kullanılan köşegen yöntemini sağlar güçlü bir temel için ilk sorun, birçok çift arasında etkileşimin test izin vererek. Bu geleneksel deneyleri bilgilendirici bir örnek yanında ikinci sorunu çözdü ve yüksek sıralı ilaç etkileşimleri çalışma sağlar.

Biz önemlisi bizim Protokolü ilaç etkileşimi ölçülerini doğrusal bir dozaj bile zayıf etkileşimler algılamak için duyarlılık sağlamak için kullandığına dikkat edin. Doğrusal dozaj için doğru konsantrasyon aralığı oluşturma bir iştir. İlk seri bir seyreltme gerçekleştirerek, biz bir doğrusal dozaj için arama alanı hakkında karar vermek. Ancak, protokol 2 kat kullanacak biçimde değiştirilmesi veya etkileşim test için daha yüksek seri dilutions uyuşturucu. Böyle bir değişiklik deneme süresini kısaltmak ve daha fazla etkileşim test izin; Ancak, yalnızca güçlü sinerjik veya antagonistik etkileşim algılamak için duyarlılık olurdu.

Biz açıklanan protokol ikili veya üçlü etkileşimleri ölçümü gösterir. Önemli bir özelliği iletişim kuralının tek ajanlar önyargı plaka varyasyonlar nedeniyle en aza indirmek için kombinasyon, aynı tabakta olmasıdır. Bu nedenle, protokol etkileşimler 7 yönlü kombinasyonları kadar ölçmek için önemsiz modifications tarafından ayarlanabilir. 7 uyuşturucu kombinasyonları birden fazla 96-şey Mikroplaka gerektirecektir ve dikkat edilecek diğer noktalar arası plate çoğaltır gibi doğru veri entegrasyonu sağlamak için alınması gerekir.

Bir önemli köşegen yöntemi her uyuşturucu tahlil faiz fenotip inhibe gerekir kısıtlama kısıtlamasıdır. Bu nedenle, köşegen yöntemi aktif maddeleri ve inert adjuvan arasındaki etkileşimler anlamak için yararlı değildir. Böyle ‘güçlendirici’ etkileşimleri Bliss veya en yüksek tek ajan modelleri gibi alternatif modeller altında okudu.

DSA’da ilaç etkileşimleri analiz için önemli bir göz “IC50 beklenen.” boş modeli bir seçimdir İki ilaç birleştirildiğinde, kasanın’ın etkisi sadece tek ilaç etkileri için karşılaştırılabilir. Üç uyuşturucu birleştirildiğinde, kasanın’ın etkisi tek efektleri veya ikili etkileri için karşılaştırılabilir. Üç uyuşturucu tüm ikili birleşimlerini sinerjik iseniz, örneğin, o zaman bu bu ilaçların bir üçlü sinerji gösterecektir beklenebilir. İkili etkileşimleri beklendiği gibi gelen bir üçlü etkileşimin sapma son zamanlarda “acil etkileşimi”¹⁶^,¹⁷dönüşmüş bulunuyor. Kolaylık olması için ölçüm “boş modeli tek ilaç etkileri tanımlayan etkileşimin Üçlü kombinasyon’ın net,” bizim protokolünü açıklar. Ancak, protokolü elde edilen veri, Üçlü kombinasyonun acil etkileşimi hesaplamak için de kullanılabilir. Bizim analizi, beklenen IC50 üçlü kombinasyonu tek ilaç IC50s ortalama tanımlı. Alternatif olarak, beklenen IC50 IC50s ikili kombinasyon (~1.1-1.2) ortalama tanımlanabilir. Gözlenen IC50 bu alternatif beklenen IC50 tarafından bölünmüş, elde edilen FIC yukarıda açıklanan¹²olarak Üçlü kombinasyon için acil FIC sağlar. Bu dikkate LEV + NAL + PNG acil sinerji sahip gösteren LEV + NAL + PNG ne 3 ilaç arasında ikili etkileşimleri üzerinden beklenir daha fazla sinerjik olduğunu ortaya koymaktadır.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu eser NIGMS Grant P50GM107618 tarafından finanse edildi. Yazarlar Zohar B. Weinstein anlayışlı yorum ve el yazması öneriler için teşekkür ederiz.

Materials

1.5 mL Semi Micro Cuvette	VWR	97000-586
1.5 mL Eppendorf Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	4036-3204
1000 µL Tips	Geneseesci	24830
14 mL Breathable Cell Culture Tube	VWR	60819-761
20 µL Tips	Geneseesci	24804
200 µL Tips	Geneseesci	24815
37 °C Incubator	Panasonic	MIR-262-PA
37 °C Shaker Incubator	Thermo Scientific	SHKE8000
5 mL Cell Culture Serological Pipette	VWR	53300-421
96-well Microplates	VWR	15705-066
Breathable Sealing Film	USA Scientific	2920-0010
DMSO	Sigma	41647
Escherichia coli	ATCC	700926
Glycerol	Sigma	G9012
LB Broth Powder	RPI	L24065
Levofloxacin	Sigma	28266
Micropipette	GILSON	PIPETMAN Classic
Microplate reader	BioTek	Synergy H1
Multichannel micropipette	VistaLab	1060
Nalidixic acid	Sigma	N8878
Penicillin G	Sigma	P3032
Pipette Pump	Drummond	4-000-501
Reagent Reservoir	VWR	89094-658
Spectrophotometer	BIO-RAD	1702525
Vortex Mixer	Fisher Scientific	10-320-807

Referanslar

Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts. Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).
Berenbaum, M. C. What is synergy?. Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).
Cokol, M. Drugs and their interactions. Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).
Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance. Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).
Lehár, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. High-order combination effects and biological robustness. Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).
Loewe, S. The problem of synergism and antagonism of combined drugs. Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).
Foucquier, J., Guedj, M. Analysis of drug combinations: current methodological landscape. Pharmacology Research & Perspectives. 3 (3), (2015).
Wood, K. B. Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).
Berenbaum, M. C. A method for testing for synergy with any number of agents. Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).
Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis. Scientific Reports. 7, 42644 (2017).
Horn, T., et al. High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells. Kanser Araştırmaları. 76 (23), 6950-6963 (2016).
Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis. Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).
Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).
Mason, D. J., et al. Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).
Yilancioglu, K., et al. Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity. Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).
Beppler, C., et al. Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors. Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).
Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs. Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).

Etiketler

Diagonal Method Synergy Multiple Drugs Systems Biology Antibiotic Aliquots Bacterial Culture Serial Dilutions LB Media DMSO LEV NAL PNG OD600 Dose-response Experiment IC50

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Cokol-Cakmak, M., Bakan, F., Cetiner, S., Cokol, M. Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs. J. Vis. Exp. (136), e57713, doi:10.3791/57713 (2018).