Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs

Melike Cokol-Cakmak; Feray Bakan; Selim Cetiner; Murat Cokol

doi:10.3791/57713

JoVE Journal > Biology

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biyoloji

Диагональный метод мера взаимодействия между любое количество наркотиков

Published: June 21, 2018

doi:

10.3791/57713

Melike Cokol-Cakmak¹, Feray Bakan², Selim Cetiner¹, Murat Cokol^1,2,3

¹Faculty of Engineering and Natural Sciences,Sabanci University, ²Nanotechnology Research and Application Center,Sabanci University, ³Laboratory of Systems Pharmacology,Harvard Tıp Fakültesi

Özet

В этом протоколе мы описываем, как сделать Loewe измерений взаимодействия на основе аддитивности наркотиков для попарно и трехходовые лекарственных комбинаций.

Abstract

Сочетание синергетический наркотиков имеет выше эффективность по сравнению с эффектами отдельных препаратов. Клетчатый анализов, где наркотики объединяются в много доз, позволяют чувствительным измерение лекарственных взаимодействий. Однако эти анализы являются дорогостоящими и не масштабируются для измерения взаимодействия среди многих препаратов. Несколько недавних исследований сообщили наркотиков взаимодействия измерений с помощью Диагональ выборки традиционном шахматном assay. Эта альтернативная методология значительно снижает стоимость наркотиков взаимодействия экспериментов и позволяет взаимодействие измерение комбинации многих препаратов. Здесь мы описываем протокол измерения трех парного взаимодействия и один 3 способ взаимодействия между тремя антибиотиков в двух экземплярах, в течение пяти дней, используя только три 96-луночных планшетов и стандартного лабораторного оборудования. Мы представляем представитель результаты показывают, что сочетание трех антибиотик левофлоксацин + Налидиксовая кислота + пенициллин G синергизма. Наш протокол масштабируется измерить взаимодействия среди многих лекарств и других биологических контекстах, позволяя эффективно экранов для множественной лекарственной синергизма против патогенов и опухоли.

Introduction

Комбинации препаратов могут exhibit удивительно высокое или низкое влияние на фенотип, учитывая последствия составляющих препаратов, соответствующих синергических или антагонистических взаимодействиях, соответственно¹^,²^,³. Использование синергетических комбинаций может позволить доза эскалации для повышения эффективности и уменьшения дозы для побочный эффект рельеф. Комбинированного лечения могут применяться несколько неудач к клеточными, тем самым блокируя потенциальных эволюционных побег механизмы сопротивления⁴. Таким образом в патогена или рака лечение⁵обычно используются комбинации трех или более препаратов.

Сравнение между наблюдаемый эффект комбинации против ожидаемого эффекта, учитывая индивидуальные наркотиков эффекты определяются синергии и антагонизм. Среди моделей для лекарственных взаимодействий Loewe аддитивности является самым строгим и имеет четко определенные null модель ()Рисунок 1)⁶, и выводимые Синергия/антагонизм взаимодействия зависит от концентрации препарата используется ⁶ ^, ⁷. Однако, модель Loewe экспериментально дорогостоящих даже для теста парного взаимодействия. Наркотиками взаимодействия анализов традиционно составляют 2D матрицы комбинаций концентрации наркотиков (клетчатый пробирного) ()Рисунок 2). Если 5 доз используются для каждого препарата, то 25 комбинаций, требуются соответствующие одной половины микроплиты, если проводятся эксперименты в репликацию. Стоимость такой подход запрещает Синергия измерения модели Loewe аддитивности множественной лекарственной комбинацийРисунок 3) (). Например чтобы проверить 10-способ взаимодействия, традиционные методы потребует более чем 100 тысяч планшетов, запрет экспериментальные измерения высокого порядка взаимодействия в строгих, хорошо theorized и концентрации независимые модели Loewe аддитивности ⁸.

Текущий стационарного лечения используют лишь небольшую часть наркотиков возможных комбинаций. Например стандартное лечение активного туберкулеза представляет собой сочетание трех антибиотиков. Есть около 20 антибиотиков, используемых в лечении туберкулез микобактерии (Mtb). Существуют возможные комбинации 3-х 1140 среди 20 наркотиков, каждый с возможность иметь сильного взаимодействия против Mtb. Как там было не экономически эффективным методом для измерения взаимодействиях среди многих препаратов, потенциально спасательные синергетических комбинаций остаются непроверенными.

Здесь мы опишем простой протокол для измерения парные и 3 way лекарственных взаимодействий путем выборки только по диагонали пробирного шахматная доска ()Рисунок 4 и Рисунок 5). Основополагающая концепция выборки Диагональ клетчатый эксперимент был предположил Berenbaum в его плодотворную работу в 1978 году⁹. Тем не менее этот подход применялся лишь недавно наркотиков Синергия экраны¹⁰^,¹¹^,¹². Мы представляем наш протокол с Escherichia coli (E. coli) и роста фенотип. Однако мы отмечаем, что протокол не зависит от биологических видов и фенотип интерес и поэтому может применяться для измерения высокого порядка наркотиков синергии в других контекстах, биологические.

Protocol

Примечание: Любые малые молекулы, который подавляет рост бактерий E. coli может использоваться для метода диагонали. В этом протоколе, Левофлоксацин (Лев), Налидиксовая кислота (НАЛ) и пенициллин G (PNG) будет использоваться в качестве примера, так как эти препараты показывают основные три пути взаимодействия. Процесс этот протокол показано, как на рисунке 6. Выполняйте все шаги при комнатной температуре. Используете свежие аликвоты бактерий и лекарства каждый день. Выполнение эксперимента по биобезопасности уровня для E. coli. 1. Подготовка шаги Подготовить Бертани Лурия (LB) СМИ, добавив 25 g LB отвара в 1 Л дистиллированной воды и перемешать. Автоклаве при температуре 121 ° C 15 мин и магазин газобетона СМИ при комнатной температуре. Подготовка E. coli глицерин запасов путем смешивания равных объемах стерильных 50% глицерина и бактериальные клетки, разбавляют до од600 = 1 LB отвара и заморозить 150 мкл аликвоты в 1,5 мл пробирок microcentrifuge-80 ° c. Растворяют 20 мг антибиотиков, Лев, НАЛ и PNG в 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО) каждый. Разбавьте Лев раствор 100 x 0,2 мкг/мл, смешивая 10 мкл раствора Лев с 990 мкл ДМСО. Используйте 0,2 мг/мл Лев и 20 мг/мл НАЛ и PNG на этапах разбирательства. Аликвота 50 мкл каждого антибиотика для 1.5 мл пробирок microcentrifuge и замораживания при температуре-20 ° C. Возьмите один из 150 мкл Алиготе кишечной палочки от-80 ° C. Оттепель. Добавьте 100 мкл биржевых глицерин E. coli в 5 мл LB СМИ в 14 мл культуры. Встряхните трубы в инкубаторе 37 ° C ночь в 200 об/мин. 2. серийный разрежения доза реакция эксперимент Возьмите один Алиготе наркотиков Лев, НАЛ и PNG от-20 ° C, оставьте их при комнатной температуре за 10 мин до разморозить и готовить для серийных разведений этих препаратов. Подготовьте 1100 мкл соль LB – 10%, смешивая 990 мкл LB СМИ и 110 мкл растворителя (ДМСО). Подготовка 500 мкл Лев LB – 10%, смешивая 450 мкл LB СМИ и 50 мкл Лев. Вихревой соль LB – 10% для 5 s на самом высоком настройки. 20 мкл соль LB – 10%, в первые четыре строки скважин в 96-луночных микропланшетов. Вихревой Лев LB – 10% для 5 s на самом высоком настройки. 20 мкл Лев LB – 10% для первой скважины в строке а. Подготовьте два раза серийный разрежения для LB – 10% лев, приняв 20 мкл от первой скважины, добавляя к второй скважины, закупорить вверх и вниз по пять раз. Повторите это для всех скважин последовательно до 11 хорошо, который заканчивается с 40 мкл (рис. 7A). Снимите и выбросьте 20 мкл контента из 11, используя микропипеткой. Повторите шаги 2.3-2.7 для наркотиков НАЛ и PNG с помощью второго и третьего рядов микроплиты, соответственно. Повторите шаги 2.3-2.7 для препарата Лев снова на четвертой строке как элемент внутреннего позитивные. С помощью спектрофотометра измеряют ОД600 1:10 разрежения культуры (шаги 1.5-1.7). Разбавьте клетки в 5 мл LB СМИ к ОД600 0,01. Залейте в резервуар. С помощью многоканального микропипеткой, добавьте 80 мкл разбавленного клеток наркотиков серийных разведений, подготовленный на шаге 2.4-2.9. Концентрации окончательный наркотиков в каждой скважине показана на рис. 7A. Уплотнение пластину для предотвращения испарения. Инкубировать пластину для 16 ч при 37 ° C. Начало новой бактериальной культуры для использования на шаге 3 (повторите шаги 1.5-1.7). 3. Линейные разрежения доза реакция эксперимент Измерение оптической плотности600 ОД для последовательного растворения доза реакция пластина из шага 2, используя читателя пластины (рис. 7A справа) и интерпретировать результаты, основываясь на следующих шагах. Нормализовать рост путем деления роста в каждой скважине с ростом без контроля над наркотиками для каждой строки и вычислить процент роста путем нормализации ОД600до состояния без наркотиков. Для каждого препарата найдите скважин, которые имеют ~ 50% замедление роста (IC50), показано в оранжевый в 7а Рисунок справа. Назначьте концентрацию в этих скважинах как «серийный IC50» для каждого препарата. Оттепель наркотиков свежие аликвоты, подготовить 1 мл соль LB – 10%, смешивая LB СМИ и растворителя (ДМСО) в соотношении 9:1 и LB – 10% препарата путем смешивания LB СМИ и наркотиков в соотношении 9:1, где концентрация препарата является 100 x последовательный IC50 каждого препарата перед добавлением LB СМИ , как выбран на шаге 3.3. Приготовить линейно возрастающих дозах лекарств Лев, НАЛ и PNG в 11 концентрации, путем смешивания LB – 10% препарата и соль LB – 10% в томах, показано на Рисунок 7B. Приготовить линейно возрастающих дозах Лев на четвертой строке как элемент внутреннего позитивные. Измерить ОД600 1:10 разрежения культуры начался в шаге 2.14. Разбавьте клетки в 5 мл LB СМИ к ОД600 0,01. Залейте в резервуар. 80 мкл разбавленного клеток на линейной разведений наркотиков, подготовленный в шаге с помощью многоканального микропипеткой 3.6. Концентрации окончательный наркотиков в каждой скважине показана на рис. 7B.Примечание: Середине хорошо в доза реакция будет получать серийный IC50 для этого препарата. Уплотнение пластины для предотвращения испарения. Инкубировать пластину для 16 ч при 37 ° C. Запустите два свежих бактериальных культур для использования на шаге 4 (повторите шаги 1.5-1.7). 4. Диагональ наркотиков взаимодействия эксперимент Измерьте absorbance600 ОД для линейного разведения доза ответ от шаг 3 (рис. 7B). Для каждого препарата выберите концентрацию, что привело к IC50 и подготовить наркотиков Лев, НАЛ и PNG в 100 x IC50 концентрации. Оттепель свежие препараты, подготовить 100 x IC50 для каждого препарата и готовить смеси наркотиков 1:1 по объему Лев + нал, Лев + PNG и НАЛ + PNG и 1:1:1 наркотиков смеси по объему Лев + нал + PNG. Подготовка двух пластин для экспериментов взаимодействия наркотиков, как показано на рисунке 8. Измерить ОД600 1:10 разведения культур начался в шаге 3.11. Подготовить ОД600 = 0.01 разведений двух культур в двух 10 мл LB СМИ. Мкл 80 клеток от культуры 1 и 2 на пластинах 1 и 2, соответственно. Уплотнение пластины для предотвращения испарения. Инкубировать пластины для 16 ч при 37 ° C. 5. Диагональ наркотиков взаимодействия баллов Мера ОД600 поглощения для диагонали препарата взаимодействия эксперимент пластины из шага 4. Нормализовать рост, разделив роста в каждой скважине с ростом без контроля над наркотиками, хорошо для каждой строки. Для каждой строки найдите столбец, имеющий торможение роста ближе к IC50, показано оранжевым цветом на рисунке 8 справа. Назначьте IC50 на основе относительной концентрации препарата в этот колодец. Лев + нал, Лев + PNG и НАЛ + PNG и Лев + нал + PNG доза реакция Рассчитайте ожидаемый IC50 путем усреднения IC50 одного наркотиков в каждой комбинации. Обратите внимание, что в среднем простой приближение для точного расчета ожидаемого IC50 как описано до12. Расчета дробных ингибирующее концентрации (FIC) баллы, разделив наблюдаемых IC50, ожидаемого IC50 в каждой комбинации.

Representative Results

Ранее мы сообщили парного взаимодействия между тремя препаратами: Лев, НАЛ и PNG основано на тестирование в миниатюрных клетчатый анализов, где два наркотиков были объединены в 4 x 4 матрицы13,14. Хотя НАЛ и Лев синергетический, PNG было сообщено быть антагонистичным с Лев и НАЛ13,14. Здесь, мы проверили эти парного взаимодействия и измеряется три пути взаимодействия среди этих трех препаратов, используя диагонали пробирного. Наши результаты показывают, что Лев + нал + PNG является сочетанием антибиотика синергетический 3-way. Схематические представления для результатов отдельных экспериментальной процедуры секции были даны в правой части Рисунка 7 и Рисунок 8. Здесь мы представляем и интерпретировать представитель необработанные результаты из трех чтениях пластины, которые приведены на рисунке 9. Верхняя пластина чтение соответствует серийный и линейное разведение экспериментов, проведенных на шагах 2 и 3. Две пластины чтений нижней являются повторяющиеся взаимодействия пластины в шаге 4. Необработанные данные на рисунке 9 показывает, что топ рост составляет около 0,55, но есть 0,05 оптической плотности СМИ, сам, как отмечено в ОД600 концентрации высокой наркотиков там, где нет роста. Таким образом, мы определяем IC50 как (0.55-0.05)/2 = 0,25. Для каждого доза реакция колодцев, расположенных ближе к этому значению отображаются с оранжевым. В верхней половине рис. 9A показывает результаты из шага 2, серийный доза ответ эксперимент. IC50 скважин для Лев находится в колонке 10 в двух реплицирует, которые соответствуют 4 нг/мл. IC50 для НАЛ и PNG находятся на 3 мкг/мл и 25 мкг/мл, соответственно. Эти концентрации соответствуют 1 x концентрации, показано на Рисунок 7B. В нижней половине Рисунок 9B показывает результаты из шага 3, линейные доза ответ экспериментов. Лев, НАЛ и PNG IC50 находятся на 0,4 x 0,8 и 1,2 x, соответственно. Эти концентрации назначаются как 1 X IC50 для шага 4. Две пластины, соответствующие два репликации, проявленную эксперименты в Рисунок 9B, где IC50 скважины показаны с оранжевым. В плита 1 все одно препараты имеют их IC50 в 1 x концентрации. Ожидаемые IC50 для комбинации попарно или 3 way рассчитывается путем арифметическое составляющих препаратов, делая ожидаемых IC50 для всех комбинаций также 1 x концентрации. В пластине 2, Лев и PNG имеют их IC50 в концентрации 1 x, но нал IC50 в 1.2 x. Ожидаемые IC50 для каждой комбинации определяется с помощью арифметических середин эти значения IC50. Например, ожидаемый IC50 для Лев + НАЛ и НАЛ + PNG — 1.1 x. Взаимодействие препарата Оценка (FIC) для каждой комбинации рассчитывается путем деления наблюдается IC50 с ожидаемой IC50, как показано на правой стороне пластины. Инспекции FIC десятки двух пластин демонстрирует, что Лев + НАЛ и Лев + нал + PNG синергетический, в то время как Лев + PNG и НАЛ + PNG антагонистические. FIC баллы, полученные в двух пластин находятся в согласии, поддерживая надежности протокола. Рисунок 1: Null определения модели для модели взаимодействия наркотиков Loewe аддитивности. Два 5 x 5 матрицы на микроплиты, где наркотиков A линейно увеличивается в одной оси, как показано в левой и верхней концентрации препарата тормозит количественно фенотип (вверху справа). Добавление этих матриц показано в середине, где линии, соединяющие равномощного наркотиков концентрации в каждом одного препарата имеют такой же концентрации как препарат а. Когда ячейки добавляются на этот «шахматная доска» комбинаций концентрации наркотиков, ожидается, что записанные фенотипа на этой линии будет эквивалентна для скважин, он подключается. В этом эксперименте взаимодействия наркотиков я я isobole, изображающих фенотип (показано зеленой пунктирной линией), как ожидается, быть линейной, определение null модели аддитивности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 2: Pairwise взаимодействиях согласно модели взаимодействия наркотиков Loewe аддитивности. При объединении двух препаратов в assay шахматной доски, как показано на рисунке 1наблюдаемые isophenotypic контур может быть прямой, выпуклой или вогнутой. Справа можно isophenotypic контуры (пунктирная зеленая линии) накладываются на шахматном анализов. Комбинации препаратов с прямыми isophenotypic контуры являются Loewe добавки, как контуры, не отличаются от взаимодействия наркотиков я я, которая Loewe-добавка по определению. Когда контур isophenotypic значительно, вогнутые или выпуклые, сочетание синергетические и антагонистические, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3: три пути взаимодействия препарата согласно модели взаимодействия наркотиков Loewe аддитивности. Подобно шахматной assay для парного взаимодействия, три наркотики, объединены в сетке 3D («checkercube»), где каждый препарат линейно увеличивается в одной оси. Если три лекарственные препараты являются идентичными, ожидается, что на isophenotypic поверхность быть плоской, определяя аддитивности три комбинации препаратов. Если поверхность более вогнутые или выпуклые, чем эта модель Loewe добавка null, комбинации препаратов синергетические и антагонистические, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4: диагональный метод измерения попарных взаимодействиях. Для каждой шахматной assay измеряются только областей, изображенных в пурпурный прямоугольников. i и ii линейно увеличивается концентрация одного препарата. iii оценку, сделав 1:1 смесь двух препаратов и линейно титрования этой смеси, как если бы это был единственный препарат. СИИ равна наблюдаемых IC50 в комбинации, деленное на ожидаемый IC50 двух препаратов один. Для модели Loewe аддитивности ожидаемые IC50 аппроксимируется средняя IC50 двух единого препаратов. FIC значение 1 для пар Loewe добавка и ниже или выше, чем 1 для синергетические и антагонистические пар, соответственно2,12. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5: диагональный метод измерения трехходовой взаимодействиях. Для каждого checkercube assay измеряются только регионы, показано. i, ii и iii линейно увеличивается концентрация одного препарата. IV измеряется путем делать 1:1:1 смесь из трех препаратов и линейно титрования этой смеси, как будто это единственный препарат. Дробные ингибирующее концентрация равна наблюдаемых IC50 в сочетании, деленное на ожидаемый IC50 дано три одного лекарства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 6: рабочий процесс для диагональный метод протокола, описанные здесь и установки детали для каждой микроплиты. Пластины, показанный на 4 день проводится в двух экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 7: последовательный и линейное разведение доза реакция эксперименты. (A) подготовка серийный разрежения доза ответ один препарат и соответствующей концентрации окончательный наркотиков. E. coli ячейки добавляются к пластине; После 16 h. серийный IC50, показано в оранжевый, выбранный для каждого препарата для использования на следующий день линейной регистрируется рост разрежения доза реакция экспериментов. (B) подготовка линейных разрежения доза ответ один препарат и соответствующей концентрации окончательный наркотиков. E. coli ячейки добавляются к пластине; рост записывается после 16 ч. Для каждого препарата отдельных IC50s, которые будут использоваться в следующий день наркотиками взаимодействия, проявленную эксперименты в оранжевый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 8: наркотиков взаимодействия экспериментов. Подготовка экспериментов взаимодействия является похож на одного препарата линейной доза реакция, за исключением 1:1 или 1:1:1 смесь препаратов используется для двух или трех наркотиков “доза реакция”, соответственно. Наблюдается IC50s для каждого доза реакция, изображенные в оранжевый, используются для вычисления FIC баллы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 9: представитель эксперимент результаты. Представитель результаты, полученные с помощью описанных протокола указаны с реквизитами, указанными в основном тексте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Использование комбинации препаратов против патогенов или опухоли является привлекательной перспективой, особенно в условиях сушки антибиотик трубопровода. Однако этот потенциал затрудняется по крайней мере две трудности. Первая трудность – это астрономическое количество возможных комбинаций. Есть, например, 4950 парного сочетаний среди 100 антибиотиков. Все возможные комбинации среди 100 антибиотики (2¹⁰⁰) находится на тот же порядок величины с количество бактерий на земле (~ 10-³⁰). Как прогнозировать сильно синергетических комбинаций среди этих возможностей был предметом многочисленных вычислительных исследований. Вторая трудность является измерение высок заказа лекарственных взаимодействий. Рассмотрим, что вычислительная платформа может предположить, что определенная комбинация 10-наркотиков сильно синергетический против определенного возбудителя. Традиционные методы для тестирования взаимодействия препарата слишком дорого подтвердить или опровергнуть эту гипотезу, поэтому изучение взаимодействия среди многих препаратов был вне границ научного исследования. Диагональный метод, который впервые был предложен почти 30 лет назад и был использован в нескольких недавних Синергия экраны обеспечивают прочную основу для первой проблемы, позволяя тестирование взаимодействия среди многих пар. Он решает второй информативный выборки традиционных анализов и позволяет исследование взаимодействий наркотиками высок заказа.

Главное, мы отмечаем, что наш протокол использует линейный дозирования для измерений взаимодействия наркотиков, для обеспечения чувствительности для обнаружения даже слабого взаимодействия. Создание право концентрация диапазон для линейных дозирования является сложной задачей. Выполняя первый серийный разрежения, мы принять обоснованное решение о пространства поиска для линейных дозирования. Однако протокол могут быть модифицированы для использования в 2 раза или выше серийных разведений для наркотиков, тестирование взаимодействия. Такое изменение будет сократить время эксперимента и позволяют тестирования больше взаимодействия; Однако он будет иметь чувствительность обнаружения только сильно синергетический или антагонистических взаимодействий.

Протокол, который мы описали показывает измерение попарно или 3 way взаимодействий. Одним из важнейших аспектов протокола является одной агентов на пластину же как сочетание, чтобы свести к минимуму предвзятость вследствие колебания пластины. Таким образом протокол может быть отрегулирован для измерения взаимодействий до 7-ходовые сочетания тривиальные модификаций. Комбинации препаратов более чем 7 потребует более чем одной 96-луночных микропланшетов и дополнительные соображения должны быть приняты для обеспечения интеграции данных, например между plate реплицирует.

Заметным ограничением диагональный метод является ограничение, что каждый препарат в assay должны препятствовать фенотип интерес. Таким образом диагональный метод не является полезным для понимания взаимодействия между активными агентами и инертных адъювантов. Такие «потенцирование» взаимодействий может быть изучена под альтернативные модели, такие как блаженство или высоким один агент моделей.

Важным фактором для анализа высок заказа наркотиков взаимодействий является null модели выбор для «ожидается IC50». При объединении двух препаратов, эффект комбинации можно сравнить только с одного препарата эффектов. При объединении трех препаратов, сочетание эффекта можно сравнить с одной эффектов или парного эффектов. Например если все парные сочетания трех препаратов являются синергетический, то можно ожидать что эти лекарства будут показывать три пути взаимодействия. Три пути взаимодействия отклонение от того, что ожидается от парного взаимодействия недавно называли «возникающим взаимодействия»¹⁶^,¹⁷. Для простоты наш протокол описывает измерение трехкомпонентные сочетания «чистой взаимодействия,» который определяет значение null модель как единственный препарат эффекты. Однако данные, полученные из протокола также может использоваться для вычисления эмерджентных взаимодействия трехходовой комбинации. В нашем анализе мы определили ожидаемых IC50 трехкомпонентные сочетания как среднее одного препарата IC50s. Кроме того ожидаемые IC50 может определяться как среднее IC50s парного сочетаний (~1.1-1.2). Когда наблюдается IC50 делится этой альтернативной ожидаемых IC50, полученные FIC предоставляет эмерджентных FIC трехходовой комбинации, как описано выше¹². Это рассмотрение показывает, что Лев + нал + PNG является более синергетический, чем то, что было бы ожидать от парного взаимодействия среди трех препаратов, демонстрируя, что Лев + нал + PNG имеет эмерджентных синергии.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась Грант P50GM107618 NIGMS. Авторы благодарят Zohar б. Вайнштейн за ценные замечания и предложения по рукописи.

Materials

1.5 mL Semi Micro Cuvette	VWR	97000-586
1.5 mL Eppendorf Microcentrifuge Tubes	USA Scientific	4036-3204
1000 µL Tips	Geneseesci	24830
14 mL Breathable Cell Culture Tube	VWR	60819-761
20 µL Tips	Geneseesci	24804
200 µL Tips	Geneseesci	24815
37 °C Incubator	Panasonic	MIR-262-PA
37 °C Shaker Incubator	Thermo Scientific	SHKE8000
5 mL Cell Culture Serological Pipette	VWR	53300-421
96-well Microplates	VWR	15705-066
Breathable Sealing Film	USA Scientific	2920-0010
DMSO	Sigma	41647
Escherichia coli	ATCC	700926
Glycerol	Sigma	G9012
LB Broth Powder	RPI	L24065
Levofloxacin	Sigma	28266
Micropipette	GILSON	PIPETMAN Classic
Microplate reader	BioTek	Synergy H1
Multichannel micropipette	VistaLab	1060
Nalidixic acid	Sigma	N8878
Penicillin G	Sigma	P3032
Pipette Pump	Drummond	4-000-501
Reagent Reservoir	VWR	89094-658
Spectrophotometer	BIO-RAD	1702525
Vortex Mixer	Fisher Scientific	10-320-807

Referanslar

Zimmermann, G. R., Lehar, J., Keith, C. T. Multi-target therapeutics: when the whole is greater than the sum of the parts. Drug Discovery Today. 12 (1), 34-42 (2007).
Berenbaum, M. C. What is synergy?. Pharmacological Reviews. 41 (2), 93-141 (1989).
Cokol, M. Drugs and their interactions. Current Drug Discovery Technologies. 10 (2), 106-113 (2013).
Yeh, P. J., Hegreness, M. J., Aiden, A. P., Kishony, R. Drug interactions and the evolution of antibiotic resistance. Nature Reviews Microbiology. 7 (6), 460-466 (2009).
Lehár, J., Krueger, A., Zimmermann, G., Borisy, A. High-order combination effects and biological robustness. Molecular Systems Biology. 4 (1), 215 (2008).
Loewe, S. The problem of synergism and antagonism of combined drugs. Arzneimittelforschung. 3 (6), 285-290 (1953).
Foucquier, J., Guedj, M. Analysis of drug combinations: current methodological landscape. Pharmacology Research & Perspectives. 3 (3), (2015).
Wood, K. B. Pairwise interactions and the battle against combinatorics in multidrug therapies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (37), 10231-10233 (2016).
Berenbaum, M. C. A method for testing for synergy with any number of agents. Journal of Infectious Diseases. 137 (2), 122-130 (1978).
Weinstein, Z. B., Zaman, M. H. Quantitative bioassay to identify antimicrobial drugs through drug interaction fingerprint analysis. Scientific Reports. 7, 42644 (2017).
Horn, T., et al. High-order drug combinations are required to effectively kill colorectal cancer cells. Kanser Araştırmaları. 76 (23), 6950-6963 (2016).
Cokol, M., Kuru, N., Bicak, E., Larkins-Ford, J., Aldridge, B. B. Efficient measurement and factorization of high-order drug interactions in Mycobacterium tuberculosis. Science Advances. 3 (10), e1701881 (2017).
Chandrasekaran, S., Cokol-Cakmak, M., Sahin, N., Yilancioglu, K., Kazan, H., Collins, J. J., Cokol, M. Chemogenomics and orthology-based design of antibiotic combination therapies. Molecular Systems Biology. 12 (5), 872 (2016).
Mason, D. J., et al. Prediction of antibiotic interactions using descriptors derived from molecular structure. Journal of Medicinal Chemistry. 60 (9), 3902-3912 (2017).
Yilancioglu, K., et al. Target-independent prediction of drug synergies using only drug lipophilicity. Journal of Chemical Information and Modeling. 54 (8), 2286-2293 (2014).
Beppler, C., et al. Uncovering emergent interactions in three-way combinations of stressors. Journal of the Royal Society Interface. 13 (125), 20160800 (2016).
Tekin, E., Beppler, C., White, C., Mao, Z., Savage, V. M., Yeh, P. J. Enhanced identification of synergistic and antagonistic emergent interactions among three or more drugs. Journal of The Royal Society Interface. 13 (119), 20160332 (2016).

Etiketler

Diagonal Method Synergy Multiple Drugs Systems Biology Antibiotic Aliquots Bacterial Culture Serial Dilutions LB Media DMSO LEV NAL PNG OD600 Dose-response Experiment IC50

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Bu Makaleden Alıntı Yapın

Cokol-Cakmak, M., Bakan, F., Cetiner, S., Cokol, M. Diagonal Method to Measure Synergy Among Any Number of Drugs. J. Vis. Exp. (136), e57713, doi:10.3791/57713 (2018).