Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Amy Stieler Stewart; John M Freund; Anthony T Blikslager; Liara M Gonzalez

doi:10.3791/57647

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Tıp

단편 작은 장 허 혈의 돼지 모델에서 문화와 장 줄기 세포 격리

Published: May 18, 2018

doi:

10.3791/57647

Amy Stieler Stewart¹, John M Freund¹, Anthony T Blikslager¹, Liara M Gonzalez¹

¹Department of Clinical Sciences,North Carolina State University

Özet

이 프로토콜에는 단편 장 허 혈의 돼지 모델을 성공적으로 설정 하 고 이후 격리 하 고 상피 수리 부상 다음의 연구에 대 한 장 줄기 세포 문화 독자 수 있게 됩니다.

Abstract

장 허 혈 병 적 상태 및 인간과 수의 환자에서 사망률의 주요 원인이 남아 있습니다. 많은 질병 과정 장 허 혈, 소장에 혈액 공급과 그러므로 산소 감소 때 발생할. 장 방 벽 손실 및 기본 조직에 손상이 리드. 장 줄기 세포 Lieberkühn의 지하실의 기지에 있으며 항상성 그리고 다음 부상 하는 동안 장 갱신에 대 한 책임이 있습니다. 셀 문화 기술을 vivo ex 상피 줄기 세포 상호 작용의 성공적인 연구에 대 한 3 차원 상피 기관 같은 시스템의 성장을 지 원하는 문화 조건을 설정 하 여 허용 (“enteroids” 나 ” colonoids”크고 작은 창 자에서 각각). 이러한 enteroids 크립 트와 모 같은 도메인으로 구성 되며 상피 내 세포 유형의 모든 포함 성숙. 역사적으로, murine 모델 장 부상 연구에 이용 되어 있다. 그러나, 돼지 모델의 크기 뿐 아니라 위장 해부학과 생리학의 인간을 포함 한 여러 가지 이점을 제공 합니다. 돼지 모델을 활용 하 여 우리는 단편 루프 장 허 혈의 단일 동물 내에서 만들 수 있습니다, 다른 연구 허 혈 성 손상의 시간 및 에 비보를 복구 하는 프로토콜을 설정 합니다. 또한, 우리 설명 소장의 허 혈 성 루프에서 장 줄기 세포 문화를 격리 하는 방법 줄기 세포에 의해 변조 상피 수리의 지속적인된 연구에 대 한 허용 비보 전.

Introduction

장 허 혈 성 손상, 감소 또는 소장에 혈액 흐름의 완전 한 폐색 감소 산소 가용성의 결과 병 적 상태와 사망률 인간과 동물 환자¹^,²의 중요 한 원인이 남아 있다. 연속적인 염증 및 세포 침투, 허 혈 성 손상, 점 막 장벽 타협 이끌어 낸다. 점 막 방 벽은 조직의 순환³^,⁴로 세균성 전 좌와 관련 된 독 소의 예방에 중요 합니다. 허 혈 성 조직의 후속 reperfusion 상해⁵악화 수 있습니다 반응성 산소 종 손상의 형성에 발생할 수 있습니다. 장 허 혈 거의 예방 이기 때문에, 최신 연구는 국 소 빈 혈의 조기 발견 및 reperfusion 상해 또는 대상 점 막 복구를 줄일 수 있는 소설 치료 접근의 개발을 위한 기술 발전에 집중 했다.

동물 모델 국 소 빈 혈 reperfusion 상해의 우리의 기본적인 과학 지식을 확장 하 고 변환 연구에 대 한 필수 유지를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 설치류 모델 될 유전자 조작된⁶을 자신의 능력으로 인해 가장 널리 사용 되었습니다. 그러나 최근에, 큰 동물 모델, 특히 돼지의 사용 장점 인간⁷^,⁸돼지 해 부와 생리 적인 유사성을 포함 하 여 수 미래 변환 연구 주장 되었습니다. 상해 모델의 다양 한 국 소 빈 혈 reperfusion 상해를 공부 하 고 완전 한 혈관 폐색, 단편 mesenteric 혈관 폐색, 낮은 흐름 허 혈 등을 개발 되었습니다. 그러나이 모델의 전체 리뷰 저자 최근 검토³독자 들을 직접이 문서의 영역 밖에 있다.

Vivo에서 모델 이외에 ex vivo 세포 배양 시스템의 사용 장 항상성 그리고 부상 다음 수리 공부를 유망한 도구를 제공 합니다. 장 줄기 세포는 세포 증식과 장내 상피 안 대기의 하는 일을 담당 합니다. 정상 또는 부상 창 자에서 분리, 장 줄기 세포 문화에서 유지 될 수 있다 고 도구 또는 줄기 세포와 상피 세포 생물학 공부 모델 역할. 격리 하 고 이러한 3 차원 설정 방법 문화 시스템 (enteroids 그리고 colonoids 각각 크고 작은 창 자에서 파생 된 경우 나) 다양 한 수 종과 기관 시스템⁹^,^{10에 대 한 설명} ^,¹¹^,^,¹²¹³. 특히, 위 장관 내에서, 이러한 문화 시스템 모델 위장 질병 암, 병원 체 감염 및 염증 성 장 질환¹⁴를 포함 하 여에 사용 되었습니다. 이 시점에서 절연 및 어떤 종에서 ischemically 부상된 소장에서 장 줄기 세포의 유지 보수를 설명 보고 있다. 따라서, 우리가 여기 소설, 큰 동물 돼지 모델에서 재현 부상과의 추가 연구에 대 한 정상 및 ischemically 부상 창 자에서 장 줄기 세포를 분리 하는 기능 귀착되는 장의 허 혈의 과정을 설명 복구 전 비보입니다.

Protocol

이 실험에 대 한 모든 동물 연구 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 노스 캐롤라이나 주립 대학에 의해 승인 되었다. 1입니다. 문화에 대 한 준비 참고: 모든 시 약은 재료의 테이블에에서 나열 됩니다. 특정 성장 인자 농도 표 1에 나열 됩니다. 이온을 제거 된 증류수 (ddH2O)에서 0.5 M ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션을 준비 합니다. 적절 하 게 혼합 하 고 NaOH 및 HCl 솔루션을 사용 하 여 7.4에 pH를 조정 합니다.참고: 각 실험 전에 신선한 EDTA 재고 솔루션을 확인 합니다. 다음과 같이 분리 시 #1 (닥터 #1)를 준비 하 고 얼음에: 결합 인산 염 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 + (PBS), 0.5 M EDTA, 1 M 1, 4-Dithiothreitol (DTT), 10 µ M 없이 버퍼링 Y27632 및 1 X 항생제 Antimycotic 솔루션 (방지) 페니실린, 스, 암포 b를 포함 하참고: 조직 컬렉션 직전 Y27632를 추가 합니다. 분리 시 #2 (박사 #2)를 다음과 같이 준비 하 고 37 ° C 물 목욕에: 캘리포니아2 + 그리고 마그네슘2 +, 0.5 M EDTA, 10 µ M 없이 결합 PBS Y27632 및 1 X 방지. 참고: 조직 컬렉션 직전 Y27632를 추가 합니다. 장 상피 줄기 세포 (IESC) 미디어를 다음과 같이 준비: 믹스 25 mL 고급 1 X n 2 보충과 DMEM/F12 매체, 1 X B-27 보충, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax 및 1 X 방지. 사용 될 때까지 4 ° C에서 저장 합니다. 다음과 같이 감소 된 성장 인자 지하실 멤브레인 매트릭스 (matrix) 및 보충 성장 요인의 마스터 믹스를 준비: 얼음에 매트릭스를 녹여. Microcentrifuge 튜브에서 100 ng/mL을 추가 재조합 인간 머리, 500 ng/mL 재조합 인간 R-Spondin 1, 50 ng/mL 재조합 인간 표 피 성장 인자 (EGF), 100 ng/mL 재조합 인간 Wnt3a, 10mm 니코틴, 10 nM gastrin, 500 nM A-83-01, 10 µ M Y-27632 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 및 2.5의 글 리 코겐 synthase 키 니 아 제 3 억제제 (GSK3i, CHIR99021). 매트릭스를 해 동 때 성장 인자 믹스 (믹스 마스터 만들기)와 함께 보충 하 고 얼음에 저장.참고: 도금 동안 매트릭스 패티 내 유물을 만들 것이 공기 방울을 소개 하지 않도록 주의 해야 합니다. 미리 따뜻하게 세포 격리 절차를 시작 하기 전에 37 ° C 배양 기에서 24-잘 조직 문화 접시. 2. 수술 모델 허 혈 및 조직의 컬렉션의 8 10 주 오래 된 요크 셔를 사용 하 여 잡종 돼지 중 섹스 (권장). 수술 전에 모든 피드 16-18 h를 제거 합니다. 돼지 물이 항상 액세스를 허용 합니다. 예약 도착 돼지 환경 새 환경 순응 수 있도록 실험 하기 전에 적어도 48 h.참고: 허용한 수 의사에 의해 감독 하는 훈련 된 동물 및 실험실 기술자 일상적인 동물 보호와 마 취 절차와 지원을 제공 합니다. Premedicate xylazine와 돼지 (1.5 mg/kg 피하 (IM))와 케 타 민 (11-20 mg/kg (IM))15. 일단 진정, 넣어야 돼지 orotracheally. 안락사의 시간까지 100% O2 에 증발 isoflurane (2-5%)와 일반 마 취 돼지를 유지 합니다. 정 맥 (IV) 카 테 터 (권장 귀 정 맥)을 놓고 15 mL/kg의 유지 속도로 lactated ringers 솔루션 등 교체 유체 관리/h. 마 취 펄스 프로브가, 심전도 및 간접 혈압 측정15를 포함 하 여 모니터링 루틴을 수행 합니다. 돼지의 호흡 속도 노력을 모니터링 하 고 수동으로 또는 끝 갯벌 공동2 55-60 mmHg 이상으로 상승 하는 경우 필요에 따라 기계적으로 환기.참고: 적절 한 마 취 심장 박동 (범위 80-130 비트/분), 비-침략 적 혈액 압력 (평균 동맥 압력 75-100 mmHg), 호흡 속도 (10 월 25 일 호흡/min)16, 및 정기 검사 동향의 지속적인 모니터링에 의해 확인 된다 대 한 턱과 항문 톤의 부재. 마 취의 깊이 또한 근육 이완과 근육 fasciculation 다음 수술 자극의 정도 의해 재판 될 수 있습니다. 눈 반사는 일반적으로 아무 값16의. 진통 기관 IACUC 정책 지시에 따라 제공 될 수 있다. 이 경우에 opioid buprenorphine, 같은 수술 중 시행 수 있습니다. 생리대에 돼지를 놓고 수술에 대 한 지 느 러 미 recumbency에서 억제 합니다. 복 부 복 부를 면도 하 고 수술 스크럽 (액체 솔루션)과 이소프로필 알코올을 사용 하 여 준비. 복 부에 액세스 하는 배꼽 중심으로 메스 블레이드를 사용 하는 8-10-cm 복 부 정중 선 절 개를 확인 합니다. 작은 창 자 (공장) 약 40 cm 구두 ileocecal 연결을 식별 합니다. 원주 창 두 번 ligating에 의해 공장의 10 cm 긴 루프 윤곽을 그리 다, 후속 만들기 전에 각 합자 한 cm 루프 10 cm 구두 위치 (그림 1). 만들 허 혈의 시간 포인트 당 2 개의 루프에 인접 한 다른 국 소 빈 혈과 허 혈에 대 한 하나 하나 reperfusion의 추가 1 시간 원하는 경우. 완전 한 국 소 빈 혈 동맥 또는 정 맥 (흐름)를 만들려면 클램프 또는 mesenteric 맥 관 구조 1, 2, 3, 및 4 h에 대 한 불독 혈관 클램프, 곡선된 테드 모기 hemostats, 또는 2-0 비 흡수 실크를 사용 하 여 선 한 다음 제거를의 1 시간에 대 한 클램프 reperfusion, 원하는 경우참고: 저자 허 혈의 모든 루프 4 h 허 혈 성 루프 시작 순서로 만들어지고 proximally (최소화 하기 위해 전체 수술 시간) 이동 진행. 해결 하기 위해 허 혈 성 장 세그먼트 이웃 인접 루프를 손상 될 수 있습니다 가능성, 허 혈 성 루프의 다양 한 수 있습니다. 이 전체 수술 시간을 변경할 수 있습니다.참고: reperfusion 시간 프레임 수 있을 다양 한 관심 또는 치료 reperfusion 기간 동안 테스트 하고자 하는 경우의 연구 문제에 따라. 그러나, 혼자 허 혈의 기간을 증가에서 더 심각한 조직 손상 되면서 reperfusion 상해 가능성이 더 상피 부상에 공헌 하지 않는다. Reperfusion 허 혈 성 손상의 가벼운 기간을 다음 역할을 담당할 가능성이 않습니다. 허 혈 시간 점 사이 복 부 커버 또는 메 마른 수건 또는 수건 클램프를 사용 하 여 폐쇄 유지.참고:이 실험에 대 한 단일 동물, 이내 8 허 혈 성 세그먼트 만들 수 있습니다. 적어도 5-10 cm는 내부 일반 컨트롤 역할을 하, 마지막 허 혈 성 루프 인접 한 추가 jejunal 세그먼트를 식별 합니다. 불독 혈관 클램프 또는 곡선된 테드 모기 hemostat 당 약 3 개의 mesenteric 배를 방해. 해야 합니다 주의 hemostat 응용 프로그램 동안 혈관은 쉽게 충격 때문에. 클램프의 문 턱에서 용기를 스택 하려고 합니다. 실험, 다음 안락사 pentobarbital 85-100 mg/kg iv,의 끝에 하트 비트 auscultated 및 각 막 반사의 손실 없이 죽음 확인 된 후 metzenbaum가 위를 사용 하 여 조직의 모든 루프를 수집 합니다. 마지막으로 허 혈 성 루프에 인접 정상 공장 적어도 5-10 cm의 제어 부분을 수집 하 여 시작 합니다. 하 고 토 굴 격리에 대 한 준비까지 얼음 차가운 PBS의 작은 용기에 각 상해 시간 지점에서 루프를 저장 합니다.참고: 원하는 경우, 허 혈 성 게 루프 충분히 조직학 및 장 줄기 세포 배양에 대 한 별도 샘플으로 분할 하 그러나, 저자는 보다 큰 대략 10 cm 긴 루프는 대부분 출혈 될 가능성이 발견 했다. 3. 암호 (줄기 세포) 격리에서 허 혈 성 및 제어 루프 소장 점 막 표면 노출 20 게이지 와이어 및 조직 집게를 사용 하 여의 각 루프 반전. 와이어 봉합 사 (2-0 비 흡수 실크 또는 동등 물)를 사용 하 여 안전 하 게 루프의 위아래를 묶어. 반전, 다음 얼음 차가운 PBS luminal 파편 제거 하에서 각 루프를 씻어. 30 분 동안 얼음에 닥터 # 1 50 mL 원뿔 튜브로 즉시 샘플을 놓습니다. 수집 제어 시작 루프와 허 혈의 기간을 점진적으로 증가의 루프 함께 하십시오. 덜 손상 된 조직 (즉, 제어 및 1 시간 허 혈 성 조직)에서 루프는 강제로, 최상의 결과 위해 손목 스냅 동요 될 수 있다. 심각 하 게 손상 된 조직 (국 소 빈 혈의 3, 4 h)에서 조직 해야 부드럽게 누 볐 어 하거나 거꾸로 토 굴 중단 및 추가 조직 파괴 하면 너무 많이 떨고 하는 때에. 튜브는 동요 하거나 얼음을 하는 동안에 매 5 분을 거꾸로 해야 합니다. 37 ° C 물 탕에서 10 분 박사 # 2로 샘플을 전송. 흔들어 또는 반전 튜브 마다 5 분. 조직 전송 후 원심 원뿔 관 표면에 뜨는 EDTA를 제거 하려면 2-4 h 손상 루프에서 닥터 # 1를 포함 된 (200 x g 5 분). 이러한 조직 매우 손상으로 지하실 이미 해리 될 가능 하다. 상쾌한을 제거 하 고 PBS (5 mL)의 작은 볼륨으로 펠 릿 resuspend 3.9 단계로 진행. 박사 # 2에서 샘플을 제거 하 고 얼음 (라벨 세척 # 1)에서 차가운 PBS의 25 mL에 직접 조직 샘플을 배치. 60 rpm에서 얼음에 궤도 셰이 커에 샘플을 놓습니다. 흔들어 또는 반전 30 각 튜브를 계속 s 마다 2 ~ 5 분. 원뿔 관 2-4 h에서 박사 # 2를 포함 하는 조직, 스핀 전송 후 표면에 뜨는 EDTA (200 x g 5 분)을 제거 하는 루프를 손상 된. 이러한 조직 매우 손상으로 지하실 해리 될 가능 하다. 상쾌한을 제거 하 고 PBS (5 mL)의 작은 볼륨으로 펠 릿 resuspend 3.9 단계로 진행. 50 µ L 약 수 또는에서 제거 세척 #1 (DR) 토 굴 분리의 정도 및 파편의 양을 확인 하기. 새로운 50 mL 원뿔 관으로 조직 배치 (워시 #2, #3, 등) 그대로 지하실 최소한의 파편과 villi 격리 될 때까지 차가운 PBS와 쉐이크의 25 mL로 가득.참고: 목표는 그대로 지하실 및 최소한의 파편 한 깨끗 한 부분을 수 있을 것입니다. 그러나 각 추가 세척 보조 조직/세포 손상에 시작 됩니다 너무 떨고 세포를 청소 합니다. 또한, 최소 오염 된 최상의 결과 세척 단계와 분리 시 약 단계에서 아닙니다 지하실은 도금 하는 경우 달성 될 것입니다. 남아 있는 조직을 제거 하 고 상쾌한, 제거에 5 분 동안 200 x g에서 50 mL 원뿔 튜브 원심 다음 PBS (5 mL)의 작은 볼륨에 남아 있는 토 굴 펠 릿 resuspend. 거꾸로 현미경을 사용 하 여, 지하실/분수의 수를 결정 하기 위해 각 샘플의 50 µ L aliquots를 검사 합니다. 목표는 50-100 지하실/50 µ L,이 최종 매트릭스 버거의 크기를 될 것입니다.참고: 샘플은 너무 집중 하 고, 계속 해 서 원하는 농도 도달할 때까지 차가운 PBS를 추가. 샘플 너무 희석 이면 원하는 암호 수익률에 도달 하 고 조정 하는 데 필요한 aliquots의 수를 결정 합니다. Microcentrifuge 튜브로 (aliquot 관측에 의해 결정 되는) 지하실의 적절 한 볼륨을 aliquot. 예를 들어 샘플 포함 50 지하실/50 µ L 다음 패티 X 3 복제 당 aliquot 50 µ L = 150 µ L / microcentrifuge 관. 샘플만 포함 25 지하실/50 µ L 다음 필요한 2 aliquots / 패티 X 3 복제 하는 경우 = 300 µ L/튜브. 4 ° c.에서 5 분 동안 200 x g에서 펠 릿 지하실 부드럽게 수송과 지하실 마스터 믹스 (잘 당 50 µ L)의 적절 한 볼륨으로 resuspend. 빠르게 공기 거품을 만들지 않고 15 번 pipetting으로 철저 하 게 혼합.참고: 사전 발음 마스터 믹스 이전에 찬 메 마른 PBS 가진 피 펫 팁 멋진. 이 밖으로 확산 마스터 믹스를 유지 도움이 됩니다. 팁 또한 냉장고에 보관 하 고 즉시 사용 하기 전에 후드에 배치 수 있습니다. 미리 데워 진된 24 잘 플레이트의 각 우물의 센터에 50 µ L 마스터 믹스 플러스 토 굴 방울을 분배. 37 ° c.에 30 분 동안 문화 접시를 품 어 500 µ L / IESC 미디어 (없음 추가 성장 요인으로 그들은 마스터 믹스에 포함 된 0에 필요한)의 각 매트릭스 패티를 오버레이 합니다. 습도 유지 하기 위해 접시에 어떤 사용 되지 않는 우물에 500 µ L 살 균 PBS를 추가 합니다. 0을 도금된 지하실의 수를 계산 합니다.참고: 각 셀 더 정확 하 게 계산 될 수 있도록 사분면으로 격판덮개 문화 사전 격자에 도움이 됩니다. Enterospheres 모든 24 h의 수를 계산 하 고 매일 enteroid 개발에 대 한 모니터링 합니다. 각 잘 모든 48 헤에 성장 인자 IESC 미디어 모든 96 h 제거와 500 µ L 신선한 미디어 (성장 인자 다음에 추가 되어야 합니다 미디어) 바꿉니다 추가 합니다.

Representative Results

완전 한 장의 허 혈 봉합 또는 클램프 그림 1에서 보듯이 혈관 폐색을 이용 하 여 작은 창 자 루프에서 만들었습니다. 클램프를 방출 하 여 reperfusion의 제어 기간 수행할 수 있습니다, 필요한 경우 후속 reperfusion 상해의 추가 연구에 대 한 허용. 모든 동물 안락사까지 최소한의 합병증과 절차 동안 살아남았다. 가장 일반적인 수술 합병증 저 혈압, dobutamine 등 긍정적인 inotrope의 보완으로 해결 했다. 제대로 수행 하는 경우 허 혈 성 부상 장 모의 끝에 시작 하 고 아래로 크립 내 허 혈 증가 (그림 2)의 기간으로 마이그레이션할. 수술 방법으로 하나의 일반적인 실수 때 혈관 출혈 하거나 균등 하 게 채워 하지 발생할 수 있습니다. 결과 출혈 성 허 혈 (그림 3), 얇은-벽으로 정 맥이 동맥, 추가 혈액 조직 침투를 허용 하기 전에 축소 하는 이다. 이것은 어두운 자주색 serosal 표면으로 (그림 3, 왼쪽) 완전 한 국 소 빈 혈 (그림 3, 오른쪽) 동안 더 창백한 표면에 비해 심하게 보인다. 허 혈 성 장 루프의 제거, 다음 장 지하실 분리 프로토콜 (그림 4)를 다음 성공적으로 격리 했다. 예상 했던 대로, 더 심각 하 게 손상 된 timepoints에서 지하실 깨진 자주 했다 (f; 조각) 토 굴 분수 포함 더 많은 배경 세포질 파편 아니오를 받았다 하는 그에 비해 가벼운 손상. 프로토콜, 동안 심각 하 게 부상된 창 자 기본 조직에 추가 손상을 방지 하기 위해 부드럽게 동요 될 해야 합니다. 떨고 너무 대략 더 크립 트 손상과 EDTA, 추가 붕괴의 결과 포함 하는 DR 솔루션에서 끝나는 지하실의 대부분에서 발생할 수 있습니다. 일단 도금, 국 소 빈 혈의 모든 시간 지점에서 지하실 생존과 문화 (그림 5)에 설립 될 수 있습니다. 문화에서 정상적이 고 약간 손상 된 장 지하실은 도금 하는 때, 24-48 시간 이내 enterospheres 형태. 심한 허 혈 성 손상 (3, 4 h), 장 지하실 생존 하지만, 처음 훨씬 더 작은 분야의 형성의 결과로 손상 된. 72-120 h, enteroids 더 명백한 중앙 루멘 및 신진 구조와 복잡 한 될. 전반적으로, 지하실의 감소 성장 효율 뿐만 아니라 심각 하 게 손상된 된 장의 조직 (곤잘레스, 임, 게시 되지 않은 데이터, 2017)에서 파생 된 enteroids의 감소 크기입니다. 그림 1 : 돼지 모델에서 완전 한 장의 허 혈의 수술 모델. Exteriorized A) 정상적인 돼지 공장입니다. B) mesenteric 혈관 봉합 만드는 장 국 소 빈 혈과 출혈 되어 있다. C) 허 혈 원하는 경우 조직 reperfusion 있도록 불독 혈관 클램프를 사용 하 여 만든. D) 장의 맥 관 구조 직후 혈관 클램프의 제거. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : 완전 한 장의 허 혈의 더 긴 기간을 따라 상피 손상을 증가의 더 증거 (hematoxylin 및 오신 (H & E) 얼룩). 손상의 끝에 모 단일 셀 상피 층, 모 blunting 및 세포 손상 심한 부상 (최대 4 h 기간) 기본 토 굴 아래로 연장의 점차적인 손실 시작 합니다. 100 µ m 규모 바입니다. 나 = 국 소 빈 혈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 : 심한 출혈 성 허 혈의 더 증거. A) 총 사진 출혈 국 소 빈 혈 (왼쪽된 루프)와 완전 한 국 소 빈 혈 (오른쪽 루프) 비교. 맥 관 구조 출혈 또는 균등 하 게 채워, 혈액 추가 염증 및 손상의 결과로 조직에 침투 하기 위해 계속 수 있습니다. 1-4 h에서 기간 증가의 출혈 성 허 혈의 B) H & E 이미지. 세포 손상을 완전 한 국 소 빈 혈으로 본, 뿐만 아니라 주변 lamina propria 내 적혈구 침투의 증거가 있다. 100 µ m 규모 바입니다. 나 = 국 소 빈 혈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4 : 허 혈 성 및 정상적인 내장의 루프에서 격리 장 지하실의 aliquots. 완전 한, 그대로 장 지하실 (별표) 내장의 각 루프에서 성공적으로 격리 했다. 예상 했던 대로, 더 심각 하 게 손상 된 시간 지점에서 지하실 깨진 자주 했다 (f; 조각) 토 굴 분수 포함 더 많은 배경 세포질 파편 아니오를 받았다 하는 그에 비해 가벼운 손상. 100 µ m 규모 바입니다. 나 = 국 소 빈 혈. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 : 격리 소장의 허 혈 성 루프에서 다음 장 줄기 세포 성장의 시간 과정. 정상적인 장 지하실 문화에 도금 했다, enterospheres 24-48 시간 이내에 형성. 심한 허 혈 성 손상 (3, 4 h), 지하실 생존 하지만 처음 훨씬 더 작은 구체를 형성. 72-120 h, enteroids 더 명백한 중앙 루멘 및 신진 구조와 복잡 한 될. 20 µ m 규모 언급 하지 않는 한 바. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 성장 인자 희석제 사진 농도 재고 희석 작업 희석 R-Spondin PBS 100 X 100 µ g/ml 1 µ g/ml 머리 SW/0.1%BSA 1000 X 100 µ g/ml 100 ng/ml EGF 10 mM 아세트산 10000 X 500 µ g/ml 50 ng/ml A-83-01 DMSO 1000 X 500 Μ M 500 nM SB202190 DMSO 3000 X 30 mM 10 Μ M 니코틴 소프트웨어 1000 X 1 M 1mm Gastrin PBS 10000 X 100 Μ M 10 nM Y-27632 PBS 1000 X 10 m m 10 Μ M LY2157299 DMSO 10000 X 5 mM 0.5 Μ M CHIR99021 PBS 1000 X 2.5 m m 2.5 Μ M Wnt3a PBS 2000 X 200 µ g/ml 100 ng/ml 표 1: 성장 인자 시 테이블. 성장 인자 재고 솔루션 및이 프로토콜에 사용 되는 작업 솔루션의 요약.

Discussion

단편 장 허 혈의 돼지 모델의 개발 같은 동물 내 조직 상해의 여러 시간 점의 연구 함으로써 이전 murine 모델에 따라 확장 합니다. 적절 한 혈관 결 찰, 성공적인 암호 세포 배양, 조직 reperfusion 등이 프로토콜의 몇 가지 중요 한 논의 점 있다.

적절 한 혈관 결 찰 완전 한 국 소 빈 혈의 모델의 생성에 필수적 이다. 봉합 균등 하 게 연결 또는 클램프 하지 완전히, 혈액에서 강화 두꺼운 동맥 조직 입력을 계속 수 있습니다 고 얇은 벽 정 맥 붕괴 때문 종료 수 없습니다. 추가 조직 손상을 일으키는 lamina propria에 혈액의 넘쳐 흐름 발생 합니다. 그러나, 공부 되 고 허 혈 성 손상의 유형에 따라 전체 또는 출혈 성 허 혈을 원하는 수 있습니다. 예를 들어 장 이식 과정에서 창 완전히 분리 절차를 완전 한 장의 허 혈의 절제 단계 혈관 공급 (동맥 및 정 맥)에서. 그러나 또는,,는 mesentery 장 volvulus 같은 이벤트 동안 트위스트는 때 정 맥 반환은 종종 방해 먼저 동맥 공급 되 고 전에 조직 내에서 추가 혈액을 선도 하는 방해, 따라서 만들기 출혈 성 허 혈입니다.

허 혈 성 손상 모 끝에 시작 하 고 토 굴³의 기지까지 확장 조직의 손상을 발생 합니다. 허 혈, 중 아데노신 3 인산 염의 형태로 에너지 사용을 계속 하 고 대사 산물 hypoxanthine를 생성 합니다. 조직이 산소와 reperfused는, hypoxanthine 세 산화 효소에 의해 대사 되 고 점 막 상해 및 조직 손상 호 중구¹⁷^,¹⁸의 초과 자유 래 디 칼 생성. 다양 한 표현의 세 산화 효소, 점 막 혈관 구조에 종 차이 reperfusion 상해³의 다양 한 각도 귀 착될. 국 소 빈 혈 reperfusion의 고양이 쥐 모델은 반응성 산소 대사 산물¹⁹^,²⁰에서 reperfusion 상해에 더 취약. 반면에, 돼지 더 적은 세 산화 효소와 따라서 적은 reperfusion 상해, 인간의 장 허 혈²¹의 더 비교이 모델을 만드는을 발견 했다. 이 시점에서 녹아웃 또는 장 부상 공부 유전자 변형 돼지 모델의 사용은 하지 설명,이이 모델의 주요 한계를 만들기. 질병 과정에 따라 적절 한 동물 모델의 선택 또는 특정 조건 연구원 공부 하고자 합니다. 예를 들어 h 6까지 허 혈 성 손상의 돼지 모델 되었습니다 설명된²², 반면 murine 모델에서 가장 허 혈 성 절차는 45-60 분²³.

정상적이 고 ischemically 손상 창 자에서 장 지하실의 성공적인 격리 문화에서 상피 복구의 연구에 대 한 수 있습니다. 이 시스템에는 초점을 유일 하 게 혼자, 상피 하지 혈관 공급 또는 고려 하는 면역 세포 구성 요소를 연구 수 있습니다. 이 상피 세포 상호 작용 및 다른 성장 인자, 또는 문화 미디어를 보완 하 여 수술 또는 다음 암호 격리 하는 동안 관리 하는 치료에 반응 이외에 상해 다음 복구를 공부 하는 기회를 제공 합니다. 이 단계에서 가장 어려운 남아 있다, 심각 하 게 손상 된 루프에서 격리를 필요로 해 서 부드러운 진동 및 EDTA를 포함 하는 솔루션의 빠른 제거 경우에 납골당 될 중간 해리. 장의 이러한 루프는 철저 하 게 세척 되지, 하는 경우는 지하실 문화에 오염 될 가능성이 있다. 결과적으로, 항생제 antimycotic 솔루션 IESC 미디어 뿐만 아니라 두 박사 솔루션에 추가 되었습니다. 또 다른 토론 지점 일반 컨트롤로 수집 소장에 중점을 둡니다. 동물 수술 마 취 보조 국 소 빈 혈, 염증 성 중재자 순환의 가능성과 함께 조직의 조직 관류에 가능한 변경 된으로 “정상” 제어 조직 진정한 컨트롤을 대표 하지 않을 수 있습니다. 이 실험에서 제어 조직 조잡 한 및 조직학에 비해 조직 (곤잘레스, 임, 게시 되지 않은 데이터, 2017) 다른 실험에서 허 혈을 받아야 하지 않은 동물에서 등장 하는 노트입니다.

요약 하자면, 돼지 장 허 혈, 그 밀접 하 게 인간의 허 혈 성 손상에서 발생 하는 어떤 모델의 재현 모델을이 방법에 설명 합니다. 또한, 허 혈 성 루프에서 장 줄기 세포의 고립은 설명,이 상피 수리 및 문화에서 치료에 대 한 가능한 응답을 공부 하는 역할.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 프로젝트는 NIH K01OD0199, NIH T32 OD011130, NIH P30DK034987, 및 부의 임상 과학 보급 자금에 의해 지원 되었다

Materials

Phosphate Buffered Saline, Ca2+, Mg 2+ free	Fisher Scientific	BP-399	Dilute 1:10
Distilled, deionized water (ddH2O)			Used to prepare EDTA and PBS
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Thermo Scientific	20688
Ethylenediamene tetraacetic acid (EDTA)	Sigma Aldrich	ED45	Make fresh before each experiment; pH 7.4
1,4-Dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	646563
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-010
N2 Supplement	Life Technologies	17502-048
B-27 Supplement	Life Technologies	12587-010
HEPES	Life Technologies	15630-106
Glutamax	Life Technologies	35050-061
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B	Gibco	15240-096	Anti-Anti solution
Recombinant human Wnt-3a	R & D Systems	5036 WN/CF
Recombinant human Rspondin1	R & D Systems	4645- RS
Recombinant human Noggin	R & D Systems	6057-NG
Recombinant human EGF	R & D Systems	236-EG
LY2157299	SelleckChem	52230
CHIR99021	Cayman Chemical	13122
Human [leu]15-Gastrin 1	Sigma Aldrich	G9145
SB202190	Sigma Aldrich	57067
A83-01	Tocris	2939
Nicotinamide	Sigma Aldrich	N0636
Acetic Acid	Sigma Aldrich	695092
Water, WFI Quality	Corning, Inc.	25-055-CM	Referred to as sterile water (SW); for growth factor stocks
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153
Matrigel Matrix, GFR	Corning, Inc.	356231	Phenol red free
24 Well Culture Dish	Corning, Inc.	3524
Conical Tube, 50 ml	Corning, Inc.	430828
Scalpel Handle	World Precision Instruments	500236
Carbon Steel Surgical Blade, No. 10	World Precision Instruments	504169
Tissue Forceps	World Precision Instruments	15918
Debakey Tissue Forceps	World Precision Instruments	501239
Mayo Scissors	World Precision Instruments	501752	Curved or straight
Metzenbaum Scissors	World Precision Instruments	501739
Mosquito Forceps, Curved	World Precision Instruments	503724-12	Curved or straight (503728-12)
Hopkins Bulldog Clamp	Stoelting Co.	52120-40P	Straight
Silk, 2-0	Henry Schein	685S-BUT	Any similar brand is acceptable
Towel Clamps	World Precision Instruments	501700
Needle Holder	World Precision Instruments	V503382
Wire suture, 20 gauge	Henry Schein	19075	Cut and straighten before use.
Surgical Towels	Henry Schein	ST1833	Any similar product is acceptable.
Lactated Ringers Solution	Henry Schein	9851
Chlorhex antiseptic scrub (4%)	Henry Schein	VINV-CHMX-SCRB	Any similar brand is acceptable
Isopropyl Alcohol 70%	Henry Schein	MS071HS	Any similar brand is acceptable
IV catheter, 22 gauge	Henry Schein	2225PUR	May need 20g or 24 g depending on size of the vein
Xylazine (100 mg/ml)	Henry Schein	33198
Ketamine (100 mg/ml)	Henry Schein	11695-6835-1	Controlled medication
Isoflurane solution	Henry Schein	10015516
Pentobarbital (Fatal Plus Euthanasia Solution (390 mg/ml))	Vortech Pharm.		Multiple brands of Pentobarbital Sodium available.
Heating pad	Gaymar		Tpump Core Warming System; others are available.
Mindray Datascope Monitor	Mindray North America		Any equivalent piece of monitoring equipment acceptable
Vaporizer	Vetland Medical		Recommended to use a Circle System w/ Y piece; multiple suppliers available.
Fluid Pump	Abbott Hospira		Plum A+; Any similar manufacturer is recommended.

Referanslar

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Intestinal Stem Cells Ischemia Porcine Model Small Intestine Crypt Isolation Epithelial Stem Cells Dissociation

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Stieler Stewart, A., Freund, J. M., Blikslager, A. T., Gonzalez, L. M. Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia. J. Vis. Exp. (135), e57647, doi:10.3791/57647 (2018).