腸幹細胞の隔離とブタモデル分節小さな腸管虚血の文化

これらの実験すべての動物の研究は、制度的動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ノースカロライナ州立大学のによって承認されました。 1. 文化のための準備 注: すべての試薬は、材料表に表示されます。特定の成長因子の濃度は表 1に示します。 脱イオン蒸留水 (ddH2O) で 0.5 M エチレンジアミン四 edta 溶液を準備します。十分に混合し、水酸化ナトリウムや塩酸のソリューションを使用して 7.4 に pH を調整します。注: は各実験の前に新鮮な EDTA 原液を作る。 次のように解離試薬 #1 (DR #1) を準備し、氷の場所: 結合リン酸緩衝生理食塩水 Ca2 +と Mg2 + (PBS) 0.5 M EDTA, 1 M 1, 4 ジチオトレイトール (DTT)、10 μ M なし Y27632 と 1 X 抗生物質抗真菌ソリューション (対策)ペニシリン、ストレプトマイシンおよびアムホテリシン b を含む注: は、直前の組織コレクション Y27632 を追加します。 解離試薬 #2 (DR #2) を次のように準備し、37 ° C の水浴中に配置: なし Ca2 +と Mg2 +、0.5 M の EDTA、10 μ M を組み合わせて PBS Y27632 と 1 X 対策。注: は、直前の組織コレクション Y27632 を追加します。 次のように腸管上皮幹細胞 (IESC) メディアの準備: ミックス 25 mL 詳細 1 X N2 サプリメント DMEM/F12 媒体、1 X B-27 補足、10 mM HEPES、2 mM Glutamax と 1 X 対策。使用するまで 4 ° C で保存します。 次のように削減成長因子基底膜マトリックス (行列) および補足の成長因子のマスター ミックスを調製: 氷の行列を解凍。微量遠心チューブに 100 ng/mL を追加組換えの人間の頭、500 ng/mL 組換えひと R Spondin 1、50 ng/mL 組換えひと上皮成長因子 (EGF)、100 ng/mL 組換え人間 Wnt3a、10 mM ニコチンアミド、10 nM ガストリン 500 nM A-83-01、10 μ M Y-27632、10 mM SB202190、500 nM LY2157299、2.5 μ M グリコーゲンのシンターゼのキナーゼ 3 の阻害剤 (GSK3i、CHIR99021)。マトリックスを解凍すると、(マスター ミックスを作る) 成長因子の組み合わせで補完、氷の上を格納します。注: これはめっき中に行列パティ内のアイテムを作成する空気の泡を防止するように気をつけてください。 中古セル分離手順を開始する前に 37 ° C のインキュベーターで 24 ウェル培養皿を温めます。 2. 手術モデルの虚血およびティッシュのコレクション 使用 8 10 週齢ヨークシャーを交配 (推奨) いずれかのセックスの豚。手術前にすべてのフィードの 16-18 h を削除します。豚のすべての回で水へのアクセスを許可します。 スケジュール到着する豚実験環境順化を許可する前に、少なくとも 48 時間。注: 認可された獣医監修獣医および/または実験室の訓練を受けた技術者は、ルーチンの動物のケアと麻酔と援助を提供します。 キシラジンと豚の premedicate (1.5 mg/kg 筋肉内 (IM)) とケタミン (11-20 mg/kg (IM))15。一度落ち着いた、豚 orotracheally を挿管します。 イソフルラン (2-5%) 安楽死の時間まで 100% O2の気化と全身麻酔下のブタを維持します。 静脈内 (IV) カテーテル (耳静脈推奨) を置き、置換液 15 mL/kg の整備率で一日リンガーズ ソリューションなどを管理/h。 パルス酸素濃度計、心電図検査と血圧測定15を含む監視麻酔ルーチンを実行します。豚の呼吸数と労力を監視し、手動でまたは機械的に終わり潮 CO2が 55 〜 60 mmHg を超える場合、必要に応じて換気します。注: 適切な麻酔心拍数 (範囲 80-130 拍/分)、非観血的血圧 (平均動脈圧 75-100 mmHg) と呼吸 (10-25 呼吸/分)16、および定期点検の傾向の継続的なモニタリングにより確認しています。顎とアナルの調子の不在。麻酔深度は次の手術刺激筋脱力と筋弛緩の程度によっても判断できます。眼反射がない値16通常です。監督機関 IACUC ポリシーとして、鎮痛を提供ことができます。この場合、手術中に、オピオイド、ブプレノルフィンなどを管理できます。 加熱パッドの豚を置き、外科処置で背の臥床で抑制します。 手術時手洗い法 (クロルヘキシジン溶液) とイソプロピル アルコールを使用しての準備し、腹側腹部を剃る。 臍を中心としたメスの刃を使用して腹部にアクセス 8-10 cm の腹側正中切開を行います。 回盲部に小腸 (空腸) 約 40 cm 口腔を識別します。円周 2 回腸を縛ることによって腸の 10 cm 長いループを描く、その後作成する前に、それぞれの合字の間 1 cm ループ 10 cm 口頭である (図 1)。 虚血の時間ポイントごと 2 つのループに隣接しお互い、虚と虚血再灌流の追加 1 h 必要に応じて作成します。完全虚血 (動脈や静脈の流れはありません) を作成するためクランプまたは 1、2、3、および 4 h のブルドッグ血管クランプ、曲線のハルステッド モスキート鉗子または 2-0 非吸収性絹糸を使用して腸間膜血管を結紮し、クランプの 1 時間を削除再灌流、希望する場合。注: 著者は 4 h 虚血性ループ順に虚血のすべてのループを作成し、近位 (総手術時間の短縮) に移動が進みます。隣接する虚血性腸管が隣接するループを損傷することの可能性に対処するため虚血性ループの順序を変えることができます。これは手術時間の合計を変更可能性があります。注: 再灌流の時間枠は、興味や灌流中にテストする場合の治療法の研究の質問に基づいて様々 なことがされます。ただし、組織の損傷はより深刻な虚血だけの期間を増やすことからになると、再灌流障害の可能性はさらに上皮損傷に寄与しません。再灌流は次の虚血性損傷の穏やかな期間役割を果たす可能性が高い。 虚血時間ポイントの間にカバーを閉じたり、滅菌タオルやタオルのクランプを使用して腹部を維持します。注: この実験のための単一動物、内 8 虚血性セグメントを作成できます。追加腸、少なくとも 5 ~ 10 cm 内部の通常のコントロールとして機能する最後の虚血性ループの近位を識別します。 ブルドッグ血管クランプまたは曲線ハルステッド モスキート止血あたり約 3 つの腸間膜血管を妨げます。血管は、簡単に傷を負ったために、止血の適用時に注意する必要があります。クランプの顎の中の血管をスタックしてみてください。 実験では, ペントバルビ タール 85 100 mg/kg iv 次安楽死の終わりに聴診ハートビート角膜反射の消失と死を確認後 metzenbaum はさみを使用して組織のすべてのループを収集します。最後の虚血性ループの近位空腸通常少なくとも 5-10 cm の制御部分を集めることによって開始します。 分離し、地下室の分離のための準備ができるまで氷冷 PBS の小さな容器で傷害の時間の各ポイントからループを保存します。注: 必要な場合する虚血性ループ長く組織や腸管幹細胞文化の別のサンプルに分割するにはしかし、著者は、ループ長さ約 10 cm より大きいの最も多い出血性になることを発見しました。 3. クリプト (幹細胞) 虚血性から分離、制御ループ 20 ゲージのワイヤと組織鉗子を使用して粘膜面を公開する小腸の各ループを反転します。縫合 (2-0 非吸収性の絹または同等) を使用してワイヤーにしっかりとループの上下を結ぶ。 次の反転、内腔のがれき撤去を氷冷 PBS の各ループをすすいでください。 すぐに DR #1 30 分間氷の上を含む 50 mL の円錐管にサンプルを配置します。 ループ制御で始まるを収集し、次の段階的虚血の期間に増加のループを持つ。以下の損傷した組織 (すなわち制御と 1 h 虚血組織) からのループは最良の結果のための手首のスナップ強制的、動揺することができます。深刻な損傷した組織 (虚血の 3 と 4 h) から組織が優しく揺れるまたはクリプト混乱と追加の組織破壊原因となりますあまりにも多くの振動だけを反転します。チューブは、動揺や氷中に 5 分ごとを反転する必要があります。 37 ° C の水浴中に 10 分間 DR #2 にサンプルを転送します。振るか 5 分ごとのチューブを反転します。 組織を転送した後、上清中の EDTA を削除する破損している 2-4 h ループから DR #1 を含む円錐管 (5 分 200 g x) を遠心します。これらの組織が非常に破損している、陰窩が解離になってすでに不可能です。上清を除去し、PBS (5 mL) の体積が小さく、ペレットを再懸濁します 3.9 の手順に進みます。 DR #2 からサンプルを取り出し、25 mL の氷 (洗浄 #1 としてラベル) の冷 PBS に直接組織サンプルを置きます。60 rpm で氷の上の軌道のシェーカーにサンプルを配置します。振ったり、30 の各チューブを反転し続ける s すべての 2 〜 5 分。 2-4 h から DR #2 を含む円錐管組織、スピンを転送した後は、EDTA の上澄み (5 分 200 g x) を削除するためにループを破損しています。これらの組織が非常に破損している陰窩が解離になることが可能です。上清を除去し、PBS (5 mL) の体積が小さく、ペレットを再懸濁します 3.9 の手順に進みます。 洗浄 #1 (または DR から) 50 μ 因数を削除のクリプト解離度と残骸の量を確認します。新しい 50 mL の円錐管に組織を配置 (洗浄 #2、#3 など) そのまま陰窩が最小限の破片と絨毛分離まで寒さの PBS と手ふれの 25 mL でいっぱい。注: 目標は、そのまま陰窩と最小限の破片のごく一部をきれいに分離することができることです。各追加の洗浄、セルの二次組織/細胞の損傷が発生する開始、しかしあまりにも多くの震動をクリーンアップします。さらに、陰窩はメッキパーツと解離試薬ステップではなく洗浄ステップから場合、少なくとも汚染で最良の結果が達成されます。 残りの組織を除去し、上清を除去する 5 分間 200 x g で 50 mL の円錐管を遠心、PBS (5 mL) の小さいボリュームに残っているクリプト ペレットを再懸濁します。 倒立顕微鏡を使用して陰窩/分数の数を決定する各サンプルの 50 μ 因数を調べます。目標は、される最終的な行列パティのサイズですが、50-100 陰窩/50 μ L です。注: サンプルがあまりにも集中して場合、は、必要な濃度に達するまで冷 PBS を追加していきます。サンプルがあまりにも希薄になる場合、必要なクリプト収量に達するし、調整に必要な因数の数を決定します。 陰窩 (分注の観察によって決まります) 微量遠心チューブに分注の適切なボリューム。たとえば、サンプルには、50 の地下室/50 μ L、パティ X 3 複製あたり 50 μ L 分注が含まれている場合 = 150 μ L/遠心チューブします。サンプルにはのみ 25 陰窩/50 μ L、必要に応じて 2 の因数が含まれます/パティ X 3 複製 300 μ L/チューブを = します。 4 ° C で 5 分間 200 x g でペレット陰窩 優しく適切な量 (50 μ L/ウェル) のマスターの組合せで小球形にされた地下聖堂を再懸濁します。急速に空気の泡を作成しなくても 15 回をピペッティングにより徹底的にミックスします。注: は、あらかじめマスター ミックスを吸引する前に冷滅菌 PBS のピペット チップを冷たい。これは広がるからマスター ミックスを保つを助けます。ヒントは、冷蔵庫に保管しを使用する前にすぐにボンネット内に配置できます。 予め温めておいた 24 well プレートの各ウェルの中心に 50 μ L マスター ミックス プラス クリプト液滴を調剤します。 37 ° C で 30 分間培養プレートを孵化させなさい 500 μ L/IESC メディア (追加の成長要因のマスターの組合せの内で含まれている、0 日目に必要) の各マトリックス パテをオーバーレイします。 任意の未使用井戸左側に湿度を維持するためにプレートに 500 μ L 滅菌 PBS を追加します。 0 日目にメッキの陰窩の数をカウントします。注: それぞれの細胞培養プレートのより正確なカウントを確保するために分割前のグリッドに便利です。 Enterospheres すべての 24 h の数をカウントし、enteroid 開発毎日監視します。 各すべての 48 h に成長因子 IESC メディアすべて 96 h の削除し、500 μ L 新鮮なメディア (成長因子はメディアに追加する必要があります) に置き換えて追加します。