De cel van de stam van de intestinale isolatie en cultuur in een varkens Model van gesegmenteerde kleine intestinale ischemie

Voor deze experimenten, werden alle dierlijke studies goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van de North Carolina State University. 1. voorbereiding voor cultuur Opmerking: Alle reagentia staan in de Tabel van materialen. Specifieke groeifactor concentraties zijn vermeld in tabel 1. Bereid een 0.5 M ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing in gedestilleerd gedeïoniseerd water (ddH2van O). Meng voldoende en breng de pH op 7.4 met behulp van NaOH en/of HCl-oplossingen.Opmerking: Make-up EDTA stockoplossing verse vóór elk experiment. Dissociatie reagens #1 (DR #1) als volgt voorbereiden en plaatsen op het ijs: combineren met fosfaat gebufferde zoutoplossing zonder Ca2 + en Mg2 + (PBS), 0.5 M EDTA, 1 M 1,4-Dithiothreitol (DTT), 10 µM Y27632 en 1 X antibiotica-Antimycotic oplossing (Anti-Anti) met penicilline en streptomycine amfotericine-B.Opmerking: Toevoegen Y27632 onmiddellijk voorafgaand aan de collectie van het weefsel. Dissociatie reagens #2 (DR #2) als volgt voorbereiden en plaatsen in een waterbad 37 ° C: PBS combineren zonder Ca2 + en Mg2 +, 0.5 M EDTA, 10 µM Y27632 en 1 X Anti-Anti. Opmerking: Toevoegen Y27632 onmiddellijk voorafgaand aan de collectie van het weefsel. Intestinale epitheliale cel van de stam (IESC) media als volgt voorbereiden: Mix 25 mL geavanceerde DMEM/F12 medium met 1 X N2 supplement, 1 X B-27 aanvullen, 10 mM HEPES, 2 mM Glutamax en 1 X Anti-Anti. Bewaren bij 4 ° C tot gebruik. Een master mix van verminderde groeifactor kelder membraan matrix (matrix) en aanvullende groeifactoren als volgt voorbereiden: ontdooien van de matrix op ijs. In een microcentrifuge buis, voeg 100 ng/mL recombinante menselijke Noggin, 500 ng/mL recombinante menselijke R-Spondin 1, 50 ng/mL recombinante menselijke epidermale groeifactor (EGF), 100 ng/mL recombinante menselijke Wnt3a, 10 mM Nicotinamide, 10 nM gastrine, 500 nM A-83-01, 10 µM Y-27632 , 10 mM SB202190, 500 nM LY2157299 en 2,5 µM glycogeen synthase 3 kinase inhibitor van de omwenteling (GSK3i, CHIR99021). Wanneer de matrix wordt ontdooid, aan te vullen met de groeifactor mix (waardoor master mix) en sla op ijs.Opmerking: Wees voorzichtig om te voorkomen dat de invoering van luchtbellen zoals dit artefact binnen de matrix patty tijdens beplating zal maken. Vooraf warm een 24-well weefselkweek schotel in een incubator 37 ° C vóór het opstarten van cel isolatie procedures. 2. de chirurgische Model van ischemie en weefsel collectie Gebruik acht tot tien weken oude Yorkshire gekruist varkens van beide geslachten (aanbevolen). Verwijder alle diervoeders 16-18 h voorafgaand aan de operatie. Toestaan dat varkens toegang tot water te allen tijde. Plannen van de varkens te komen ten minste 48 uur vóór de experimenten met het oog op milieu acclimatisering.Opmerking: Opgeleide veterinaire en/of laboratorium technici begeleid door een vergunning gegeven dierenarts geven routinematige dierenverzorgers en bijstand met verdoving procedures. Premedicate van het varken met xylazine (1,5 mg/kg intramuscularly (IM)) en ketamine (11-20 mg/kg (IM)),15. Zodra bezadigd, intubate de orotracheally van het varken. Handhaven van varkens onder narcose met Isofluraan (2-5%) verdampt in 100% O2 tot het tijdstip van euthanasie. Plaatsen van een intraveneuze (IV) katheter (oor ader aanbevolen) en beheren van een vloeistof vervanging zoals lactated ringers oplossing tegen een tarief onderhoud van 15 mL/kg/h. Het uitvoeren van routinematige verdoving toezicht met inbegrip van de pols oxymetrie, electrocardiografie en indirecte bloeddruk metingen15. Toezicht op de ademhaling en de moeite van het varken en ventileren handmatig of mechanisch desgewenst als einde getijde CO2 boven 55-60 mmHg stijgt.Opmerking: Passende verdoving wordt bevestigd door de voortdurende monitoring van trends in hartslag (bereik 80-130 slagen/min), niet-invasieve bloeddruk (gemiddelde arteriële druk 75-100 mmHg), respiratoire tarief (10-25 adem/min)16en periodieke controle afwezigheid van kaak en anale Toon. Diepte van anesthesie kan ook worden beoordeeld door mate van ontspanning van de spier en spier Fasciculatie na chirurgische stimulans. Oogbeschadigingen en/of reflexen zijn meestal van geen waarde16. Analgesia kan worden verstrekt, zoals aangegeven door het beleid van de IACUC instellingen. In dit geval kan een opioïden, zoals buprenorfine, tijdens een operatie worden toegediend. Plaats het varken op een verwarming pad en beperken in dorsale lighouding voor de chirurgische ingreep. De ventrale buik scheren en prep met behulp van chirurgische scrub (chloorhexidine oplossing) en isopropyl alcohol. Maak een insnijding van de 8-10-cm ventral midline toegang krijgen tot de buik met een scalpel blad gecentreerd op de navel. Het identificeren van de dunne darm (jejunum) ongeveer 40 cm mondelinge naar de kruising ileocecal. Tien-cm lange lussen van jejunum door omtrek tweemaal ligating de darm af te bakenen, één cm tussen elke ligatuur, vóór het maken van daaropvolgende lussen 10 cm gelegen mondeling (Figuur 1). Maak twee lussen per tijdstip van ischemie grenzend aan elkaar, één voor ischemie en één voor ischemie met een extra 1h van reperfusie, indien gewenst. Tot volledige ischemie (geen stroom van slagaders of aders), klem of de mesenterische therapieën met bulldog vasculaire klemmen, gebogen Halstead mosquito hemostats of niet-absorbeerbare zijde van de 2-0 voor 1, 2, 3 en 4h afbinden en verwijder klemmen voor 1h van reperfusie, indien gewenst.Opmerking: De auteurs gemaakt van alle lussen van ischemie in volgorde, beginnend met de ischemische lus van 4h en gevorderd verplaatsen proximally (totale chirurgie om tijd te minimaliseren). Om aan de mogelijkheid dat het naburige ischemische intestinale segmenten aangrenzende lussen kan beschadigen, kan de volgorde van de ischemische lussen worden gevarieerd. Dit kan totale chirurgische tijd wijzigen.Opmerking: Het tijdsbestek van reperfusie kan gevarieerd worden afhankelijk van de onderzoeksvraag van belang of als therapieën wenst te beproeven reperfusie deperiode. Echter zoals weefselschade ernstiger van verhoging van de totale duur van ischemie alleen, reperfusie schade waarschijnlijk draagt niet bij tot verdere epitheliale schade. Reperfusie speelt waarschijnlijk een rol na milde perioden van ischemische schade. Houd de buik bedekt of gesloten met behulp van een steriele handdoek en/of een handdoek klem tussen ischemie tijdstippen.Opmerking: Binnen een enkel dier voor dit experiment, acht ischemische segmenten kunnen worden gemaakt. Een extra jejunal segment, ten minste 5-10 cm proximaal aan de laatste ischemische lus, die als een normale internecontrolekader dienen zal identificeren. Ongeveer drie mesenterische schepen per bulldog vasculaire klem of gebogen Halstead mosquito hemostat belemmeren. Wees voorzichtig tijdens hemostat toepassing omdat de schepen zijn gemakkelijk getraumatiseerd. Probeer te stapelen de schepen binnen de kaken van de klemmen. Aan het einde van het experiment, volgende euthanasie met pentobarbital 85-100 mg/kg IV, verzamelen alle lussen van weefsel met behulp van metzenbaum de schaar, na de dood is bevestigd met geen hartslag auscultated en verlies van de cornea reflex. Begin met het verzamelen van een stuk van de controle van normale jejunum minstens 5 – 10 cm proximaal aan de laatste ischemische lus. Scheiden en opslaan van de lussen van elk punt van de tijd schade in kleine recipiënten van ijskoud PBS tot klaar voor crypt isolatie.Opmerking: Indien gewenst, make ischemische lussen lang genoeg om te verdelen in afzonderlijke monsters voor histologie en intestinale cel van de stam cultuur; Nochtans, hebben de auteurs gevonden dat loops groter is dan ongeveer 10 cm lang waarschijnlijk zijn tot hemorragische. 3. crypt (de cel van de stam) isolatie van ischemische en controlelussen Elke lus van dunne darm met behulp van een 20-gauge draad en weefsel pincet bloot van de mucosal oppervlakte omkeren. Het binden van de boven- en onderkant van de lus veilig met de draad met hechtdraad (2-0 niet-absorbeerbare zijde of gelijkwaardig). Spoel na inversie, elke lus in ijs koud PBS luminal puin te verwijderen. Leg monsters onmiddellijk in 50 mL conische buizen met DR #1 op het ijs gedurende 30 minuten. Verzamelen van lussen die beginnen met de controle en volg met lusjes van incrementeel toenemende duur van ischemie. Lussen van minder beschadigde weefsel (d.w.z. controle en 1 h ischemische weefsel) kunnen krachtig, worden geschud breuk van de pols voor de beste resultaten. Weefsels van ernstig beschadigde weefsel (3 en 4 h van ischemie) moeten voorzichtig worden wiegde of omgekeerde alleen als teveel schudden leiden verstoring van de crypte en extra weefselvernietiging tot zal. Buizen moeten worden geschud of omgekeerd elke 5 min terwijl op ijs. Pipetteer monsters in DR #2 gedurende 10 minuten in een waterbad 37° C. Schud of omkeren buizen elke 5 min. Centrifugeer na het overbrengen van de weefsels, de conische buisjes met DR #1 van de 2-4 h beschadigd lussen te verwijderen van de EDTA supernatant (200 x g gedurende 5 minuten). Als deze weefsels zijn sterk beschadigd is het mogelijk dat de crypten hebben al worden losgekoppeld. Verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet met een klein volume van PBS (5 mL) en ga verder met stap 3.9. Monsters uit DR #2 verwijderen en plaatsen van weefselmonsters rechtstreeks in 25 mL koude PBS op ijs (label als Wash #1). Leg de monsters op een roteerschudapparaat op ijs op 60 rpm. Blijven schudden of omkeren van elke buis voor 30 s elke 2 tot en met 5 min. Na het overbrengen van de weefsels, draai de conische buisjes met DR #2 van de 2-4 h beschadigd lussen te verwijderen van de EDTA supernatant (200 x g gedurende 5 minuten). Als deze weefsels zijn sterk beschadigd is het mogelijk dat de crypten los moeten worden gezien. Verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet met een klein volume van PBS (5 mL) en ga verder met stap 3.9. Verwijderen van een hoeveelheid van 50 µL van Wash #1 (of van de DR) om te controleren of de mate van crypt dissociatie en hoeveelheid puin. Plaats van weefsel in een nieuwe conische tube van 50 mL (Wash #2, #3, etc.) gevuld met 25 mL koude PBS en schud totdat intact crypten geïsoleerd met minimale puin en villi zijn.Opmerking: Het doel is om het isoleren van een schone breuk met intact crypten en minimale puin te kunnen. Elke extra wassen zal het schoonmaken van de cellen echter teveel schudden beginnen zal te resulteren in secundaire weefsel/celbeschadiging. Bovendien zal de beste resultaten met de minste verontreiniging worden bereikt als crypten zijn verguld uit een wassen stap en niet uit een dissociatie reagens stap. Verwijder het resterende weefsel en de conische buisjes van 50 mL bij 200 x g Centrifugeer gedurende 5 minuten om te verwijderen van de bovendrijvende substantie en resuspendeer de resterende van de crypte pellet in kleinere hoeveelheid PBS (5 mL). Met behulp van een omgekeerde microscope, onderzoeken 50 µL aliquots van elk monster te bepalen aantal crypten/breuk. Het doel is 50-100 crypten/50 µL, omdat dit de grootte van de uiteindelijke matrix patty.Opmerking: Als het monster te geconcentreerd is, blijven koud PBS toevoegen tot de gewenste concentratie wordt bereikt. Als voorbeeld ook verdund is, Bepaal hoeveel aliquots moest bereiken gewenste crypt opbrengst en aan te passen. Aliquot passende volumecapaciteit van crypten (bepaald door de hoeveelheid opmerkingen) in een microcentrifuge buis. Bijvoorbeeld, als monster bevat 50 crypten/50 µL dan aliquoot 50 µL per patty X 3 repliceert = 150 µL / microcentrifuge buis. Als het monster alleen bevat 25 crypten/50 µL dan 2 aliquots nodig / patty X 3 repliceert = 300 µL/buis. Pellet crypten bij 200 x g gedurende 5 min bij 4° C. Zachtjes resuspendeer Ingehuld crypten met passende omvang van master mix (50 µL per putje). Meng door snel pipetteren 15 keer zonder dat er luchtbellen.Opmerking: Cool vooraf het uiteinde van de pipet met koude steriel PBS voorafgaand aan de master mix aspirating. Dit zal helpen voorkomen dat de master mix uitspreiden. Tips kunnen ook in de koelkast bewaard worden en in de kap geplaatst onmiddellijk vóór gebruik. Afzien van een 50 µL master mix plus crypt druppel in het midden van elk putje van een voorverwarmde 24 goed plaat. Incubeer de plaat van de cultuur gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Overlay elke matrix patty met 500 µL / goed van IESC media (geen extra groeifactoren die nodig zijn op dag 0, zoals zij zijn vervat in de master mix). 500 µL steriel PBS toevoegen aan elke ongebruikte putjes links op de plaat om vochtigheid. Aantal vergulde crypten op dag 0.Opmerking: Het is handig om pre raster elke cel cultuur plaat in kwadranten om ervoor te zorgen dat nauwkeuriger tellen. Aantal enterospheres elke 24 h tellen en controleren voor enteroid ontwikkeling dagelijks. Het toevoegen van groeifactoren aan elke goed elke 48 h. de IESC media elke 96 h Verwijder en vervang door 500 µL verse media (groeifactoren moet vervolgens worden toegevoegd aan media).