猪节段性小肠缺血模型中肠道干细胞的分离与培养

在这些实验中, 所有动物研究都获得了北卡罗来纳州立大学机构动物保育和使用委员会 (IACUC) 的批准。 1. 文化的准备 注意: 所有试剂都列在材料表中。特定的增长因子浓度在表 1中列出。 在蒸馏去离子水 (ddH2O) 中制备0.5 米乙二胺乙酸 (EDTA) 溶液。使用氢氧化钠和/或 HCl 溶液, 充分混合并调整 pH 值为7.4。注: 在每次试验前, 应先将 EDTA 库存溶液进行保鲜。 准备离解试剂 #1 (DR #1) 如下和放置在冰上: 将磷酸盐缓冲生理盐水与无 Ca2 +和 Mg2 + (PBS)、0.5 米 EDTA、1M 14-Dithiothreitol (德勤)、10µM Y27632 和1X 抗生素防霉溶液 (抗反) 结合在一起。含青霉素、链霉素和两性霉素 B。注: 在组织收集前立即添加 Y27632。 准备离解试剂 #2 (DR #2) 如下和放置在37°c 水浴: 结合 PBS 没有 Ca2 +和镁2 +, 0.5 米 EDTA, 10 µM Y27632 和1X 抗反。注: 在组织收集前立即添加 Y27632。 制备肠道上皮干细胞 (IESC) 培养基如下: 混合25毫升先进的 DMEM/F12 培养基与 1X N2 补充, 1X B-27 补充, 10mM HEPES, 2mM Glutamax 和1X 抗反。存储在4°c, 直到使用。 准备一个主要的组合, 减少生长因子基底膜基质 (基质) 和补充生长因子如下: 在冰上解冻基质。在离心管中, 添加 100 ng/毫升重组人的脑袋, 500 ng/毫升重组人 R-Spondin 1, 50 ng/毫升重组人表皮生长因子 (EGF), 100 ng/毫升重组人 Wnt3a, 10 毫米烟酰胺, 10 nm 胃泌素, 500 nm A-83-01, 10 µM Y-27632, 10 毫米 SB202190, 500 nM LY2157299 和2.5 µM 糖原合成酶激酶3抑制剂 (GSK3i, CHIR99021)。当基质解冻时, 补充与生长因子混合 (使主混合) 和储存在冰上。注意: 小心避免引入气泡, 因为这将在电镀过程中在基体帕蒂中产生工件。 在开始细胞隔离程序之前, 在37°c 孵化器中预热一个24井组织培养皿。 2. 缺血和组织收集的外科模型 使用八至十周大的约克郡杂交猪的任何性别 (推荐)。手术前取出所有饲料16-18 小时。让猪在任何时候都能接触到水。 安排猪在实验前到达至少48小时, 以便进行环境驯化。注: 经过培训的兽医和/或实验室技术员由有执照的兽医监督, 提供例行的动物护理和辅助麻醉程序。 Premedicate 猪与甲苯噻嗪 (1.5 毫克/千克肌肉 (im)) 和氯胺酮 (11-20 毫克/千克 (im))15。一旦镇静, 将猪 orotracheally 插管。 在全身麻醉下, 用异氟醚 (2-5%) 在 100% O2中汽化, 直至安乐死为止。 放置静脉注射 (IV) 导管 (推荐的耳静脉), 并管理替代液体, 如乳酸枪手溶液, 维持率为15毫升/千克/小时。 进行例行麻醉监测, 包括脉冲氧, 心电图和间接血压测量15。如果最终潮汐 CO2上升到 55-60 mmHg 以上, 则需要手动或机械地监测猪的呼吸速率和工作情况。注: 通过持续监测心率 (范围80-130 节拍/分钟)、无创性血压 (平均动脉压 75-100 mmHg) 和呼吸率 (10-25 次呼吸/分钟)16和周期性检查来证实适当的麻醉。因为没有下巴和肛门的音调。麻醉深度也可以根据手术刺激的肌肉松弛程度和肌肉 fasciculation 来判断。眼睛反射通常没有值16。镇痛可以提供由机构 IACUC 政策指导。在这种情况下, 一种阿片类药物, 如丁丙诺啡, 可以在手术期间进行管理。 将猪放在加热垫上, 并在背卧床上抑制手术。 用手术磨砂 (洗必泰溶液) 和异丙醇来剃腹腹部和准备。 使用以脐为中心的手术刀刀片进入腹部, 进行8-10 厘米腹中线切口。 鉴别小肠 (空肠) 约40厘米口服到回盲交界。在创建随后的循环10厘米 (图 1) 之前, 用圆周将肠结扎两次, 在每条结扎之间形成一个厘米, 划定十厘米长的空肠环。 创建两个循环, 每个时间点的缺血相邻, 一个为缺血, 一个为缺血, 如果需要额外的1h 再灌注。要创建完全缺血 (无论是动脉或静脉的流动), 钳或结扎肠系膜血管使用牛头犬血管钳, 弯曲霍尔斯特德蚊子止血剂, 或2-0 不可吸收的丝绸 1, 2, 3 和 4h, 然后删除夹具1h再灌注, 如果需要的话。注: 作者创建了所有的缺血循环, 从4h 缺血性循环开始, 进展到下部 (以尽量减少总手术时间)。为解决相邻缺血性肠段可能损害相邻循环的可能性, 缺血性循环的顺序可以改变。这可能会改变总的手术时间。注: 再灌注的时间范围可以根据感兴趣的研究问题或是否希望在再灌注期进行试验的方法来改变。然而, 随着缺血时间的增加, 组织损伤变得更加严重, 再灌注损伤可能不会导致进一步的上皮损伤。再灌注在轻度缺血性损伤后可能起到作用。 在缺血时间点之间, 用无菌毛巾和/或毛巾钳保持腹部覆盖或闭合。注: 在单个动物的实验中, 可以创建八个缺血性片段。确定一个额外的空肠段, 至少5-10 厘米近到最后的缺血性循环, 这将作为一个内部正常控制。 每只牛头犬血管钳或弯曲霍尔斯特德蚊子止血大约三肠系膜血管阻塞。在止血的应用中必须注意, 因为血管容易受到创伤。试着堆叠在夹子的颚内的容器。 在实验结束后, 与戊巴比妥85-100 毫克/千克 IV 的安乐死后, 收集所有循环的组织使用 metzenbaum 剪刀, 死后已确认没有心跳别人听诊和丧失角膜反射。首先收集一个正常空肠的控制块, 至少近 5-10 厘米到最后一个缺血性循环。 将每个伤害时间点的循环分开并存储在冰冷 PBS 的小容器中, 直到准备好进行隐窝隔离。注: 如果需要, 使缺血性循环足够长, 分成单独的标本, 用于组织学和肠道干细胞培养;然而, 作者发现, 超过约10厘米长的循环最有可能成为出血。 3. 隐窝 (干细胞) 与缺血性和控制回路分离 用20口径的线和组织钳反转小肠的每个回路, 以暴露粘膜表面。使用缝合 (2-0 不可吸收的丝绸或同等物) 将环的顶部和底部牢固地连接到导线上。 反转后, 在冰寒 PBS 中冲洗每个回路, 以去除腔内碎片。 将样品立即放入50毫升锥形管中, 含 DR #1 在冰上30分钟。 收集循环从控制开始, 并跟随循环递增增加的持续时间的缺血。从损伤较小的组织 (即控制和1小时缺血性组织) 的循环可以有力地动摇, 捕捉手腕, 以取得最佳效果。严重受损组织 (3 和4小时的缺血) 应轻轻摇晃或反转, 只有太多的震动会导致隐窝破坏和额外的组织破坏。在冰上每5分钟应摇动或倒管。 在37°c 水浴中将样品转移到 DR #2 10 分钟。每5分钟摇动或反转管子。 在转移组织后, 离心机中含有 DR #1 的圆锥管从2-4 小时损坏的循环中去除 EDTA 上清 (200 x g 5 分钟)。由于这些组织受到高度的破坏, 这是可能的墓穴已经成为离解。用小体积的 PBS (5 毫升) 除去上清和并用重悬颗粒, 然后进行步骤3.9。 从 DR #2 取出样品, 并将组织样品直接放入冰上25毫升的冷 PBS (标签为洗涤 #1)。将样品放在 60 rpm 的冰上的轨道振动筛上。每次2至5分钟, 每管继续摇晃或反转。 转移组织后, 将含有 DR #2 的圆锥管旋转2-4 小时, 以除去 EDTA 上清 (200 x g 5 分钟)。由于这些组织受到高度的破坏, 这是可能的墓穴已成为离解。用小体积的 PBS (5 毫升) 除去上清和并用重悬颗粒, 然后进行步骤3.9。 去除50µL 整除从洗涤 #1 (或从 DR) 检查地窖离解的程度和碎片的数量。将组织放入一个新的50毫升圆锥管 (洗涤 #2, #3 等) 填充25毫升的冷 PBS 和动摇, 直到完整的墓穴被隔离, 最小的碎片和绒毛。注: 目标是能够隔离干净的分数与完整的地窖和最小的碎片。每个额外的洗涤将清理细胞, 但太多的震动将开始导致二次组织/细胞损伤。此外, 如果将地窖从洗涤步骤中镀出, 而不是从离解试剂步骤中分离出来, 则最好的结果是最少污染。 除去剩余的组织和离心机的50毫升圆锥管在 200 x g 5 分钟, 以清除上清, 然后并用重悬剩余的隐窝颗粒小体积的 PBS (5 毫升)。 使用倒置显微镜, 检查每个样本的50µL 整除数, 以确定墓穴/分数的数量。目标是 50-100 crypts/50 µL, 因为这将是最终矩阵帕蒂的大小。注: 如果样品过于集中, 继续添加冷 PBS, 直到达到预期浓度。如果样品太稀, 确定达到所需的隐窝产量和调整所需的整除数数量。 整除适当容积 (由整除观察确定) 成离心管。例如, 如果样本包含 50 crypts/50 µL 然后整除50µL 每个帕蒂 X 3 复制 = 150 µL/离心管。如果样本只包含 25 crypts/50 µL 然后2整除数需要/帕蒂 X 3 复制 = 300 µL/管。 200 x g 的球囊在 4°c 5 分钟。 轻轻地并用重悬颗粒的地窖与适当的体积的主混合 (50 µL 每井)。在不产生气泡的情况下, 快速吹打15次混合。注: 预冷却的吸管尖端与冷不育 PBS 之前, 吸主混合。这将有助于保持主混合不扩散。小贴士也可以放在冰箱里, 并放在引擎盖上立即使用。 将50µL 主混合加上隐窝液滴进入预热前24井板的每个井的中心。 在37摄氏度孵化培养板30分钟。 覆盖每个矩阵帕蒂与500µL/井的 IESC 媒体 (没有额外的增长因素需要在0天, 因为它们是包含在主混合)。 将500µL 无菌 PBS 添加到板上遗留的任何未使用的井中, 以保持湿度。 计数被镀的地窖的数量在天0。注意: 将每个细胞培养板预先栅格化, 有助于确保更准确的计数。 enterospheres 每24小时计数, 并监测 enteroid 发展每日。 每隔48小时将生长因子添加到每一个井中. 每96小时移除 IESC 介质, 并替换为500µL 新鲜介质 (必须将生长因子添加到介质中)。