リーシュ マニア、ひと細胞およびマウス精巣におけるプロファイリングをポリソーム

細胞の遺伝子発現制御は、転写、転写、翻訳のメカニズムによって制御されます。ディープの RNA シーケンスの進歩は、前例のないレベルでゲノム スケールで定常状態の mRNA のレベルの研究を許可します。しかし、最近の知見は、定常 mRNA レベルがない、常にタンパク質生産^1,2と相関を明らかにしました。個々 のトラン スクリプトの運命は非常に複雑な内部/外部刺激、ストレスなどのような多くの要因によって異なります。タンパク質の生合成遺伝子発現の調節は、状況の変化にすばやく応答するために必要な式コントロールの別の層を提供します。ポリソーム (または”polyribosome”) のプロファイリング、分離と積極的にリボソームの翻訳の可視化は、タンパク質合成の調節を研究する強力な方法です。最初の実験的応用は 1960 年代³に登場、ポリソームのプロファイリングは現在タンパク質翻訳研究⁴で最も重要なテクニックの 1 つ。単一の Mrna は、ポリソームの形成につながる 1 つ以上のリボソームで翻訳できます。成績証明書はシクロヘキシミド⁵リボソーム上停止することができ。、ショ糖勾配遠心^6,7ポリソーム分別過程で Mrna はポリソームの別の番号を含むを分けることができます。^,8,9. polysomal 分画の RNA 解析、により個々 の mRNAs の並進状態の変化の測定、ゲノム規模で、さまざまな生理的条件^4,7,中¹⁰. メソッドは、5′ UTR と 3′ UTR シーケンス mRNA 訳し¹¹の制御の役割を明らかにする、翻訳抑制¹²の Mirna の役割を調べる、リボソーム生合成^{13 の欠陥を明らかにも使用されています}、および人間の病気^14,15にリボソーム蛋白質の役割を理解します。過去 10 年間の中には、ヒトの疾患におけるその重要性を示す翻訳中に遺伝子発現の役割の拡大が浮上しています。がん、代謝における翻訳調節と神経変性疾患のための証拠は、圧倒的な^15,16,17,18です。EIF4E 依存翻訳調節の調節不全に貢献するたとえば、自閉症関連の赤字¹⁵と FMRP¹⁴自閉症にリンクされている Mrna にリボソームの失速に関与しています。したがって、polysomal プロファイルは、複数の人間の病気の翻訳制御の欠陥を研究する非常に重要なツールです。

Polysomal 分数別の生理学的条件下での蛋白質の解析は、翻訳中のリボソームと関連因子の関数を暴き出します。ポリソーム プロファイリング手法は、酵母、哺乳類細胞、植物、原生動物^10,19,20,21など多くの種で使用されています。原虫トリパノソーマリーシュ マニアなどの遺伝子発現の転写調節機構限定展示します。そのゲノムはプロモーター規制転写²²を持たないコードする遺伝子クラスターに分類されます。代わりに、発達の遺伝子発現は主にタンパク質翻訳およびトリパノソーマ科種^23,24で mRNA の安定性のレベルで制御されます。したがって、転写制御の不在で並進制御の理解はこれらの有機体のため特に重要です。Polysomal ・ プロファイリングは、リーシュ マニア^25,26,27,28遺伝子発現の転写後調節を研究する強力なツールです。

現実では個々 の mRNAs レベルの検出の最近の進歩は時間 (RT qPCR) の量的な PCR とプロテオミクス技術と同様、次世代シーケンシングによるトランスクリプトーム、解像度、新しいレベルに polysomal プロファイルの利点をもたらします。これらのメソッドの使用は、ディープの RNA シーケンス細胞ゲノム規模での並進状態を監視するプロテオーム解析の併用による個々 の polysomal 分画の解析によってさらに拡張できます。これは、異なる生理学的および病理学的条件の下で翻訳を調節する新規分子プレイヤーの識別できます。ここでは、提案する 3 つのモデルで使用されるプロトコルをプロファイリング ユニバーサル ポリソーム: 原虫リーシュ マニア原虫、培養細胞、動物組織。異なった有機体、勾配条件の最適化、RNase 阻害剤の選択と本研究でポリソーム分数を分析する RT qPCR、西部のしみ、RNA の電気泳動の適用からのセル lysates の準備でのアドバイスを紹介します。