Polysome perfilado en Leishmania, las células humanas y testículo de ratón
Özet
El objetivo general de la técnica de generación de perfiles polysome es análisis de actividad traslacional de mRNAs individuales o transcriptoma mRNAs durante la síntesis de proteínas. El método es importante para los estudios de regulación de la síntesis de proteínas, activación de la traducción y represión en salud y múltiples enfermedades humanas.
Abstract
Expresión de la proteína adecuada en el momento adecuado y en las cantidades adecuadas es la base de la función normal de la célula y la supervivencia en un entorno rápidamente cambiante. Durante mucho tiempo, los estudios de expresión génica fueron dominados por la investigación a nivel transcripcional. Sin embargo, los niveles de estado estacionario de mRNAs no se correlacionan bien con la producción de proteínas, y la traducción de los mRNAs varía grandemente dependiendo de las condiciones. En algunos organismos, como el parásito Leishmania, la expresión de proteínas está regulada principalmente a nivel traslacional. Estudios recientes demostraron que dysregulation de traducción de proteínas se asocia con cáncer, metabólico, neurodegenerativas y otras enfermedades humanas. Polysome perfilado es un poderoso método para estudiar la regulación de la traducción de proteínas. Permite medir el estado traslacional de mRNAs individuales o estudiar traducción en una escala genoma-ancha. La base de esta técnica es la separación de polisomas, ribosomas, sus subunidades y mRNAs gratis durante la centrifugación de un citoplásmico lisado a través de un gradiente de sacarosa. Aquí, presentamos un universal polysome perfiles protocolo utilizado en tres modelos diferentes – parásito Leishmania major, células humanas cultivadas y tejidos animales. Las células de Leishmania crecen libremente en suspensión y células humanas cultivadas crecen en monocapa adherente, mientras que el testículo del ratón representa una muestra de tejido animal. Así, la técnica se adapta a todas estas fuentes. El protocolo para el análisis de fracciones polysomal incluye la detección de los niveles de mRNA por RT-qPCR, proteínas por Western blot y análisis de ARN ribosómico mediante electroforesis. El método puede ampliarse aún más por la examinación de mRNAs de asociación con el ribosoma a nivel de transcriptoma por RNA-seq profunda y análisis de proteínas ribosoma asociados por espectroscopía de masas de las fracciones. El método se puede ajustar fácilmente a otros modelos biológicos.
Introduction
Regulación de la expresión génica en las células es controlada por mecanismos transcripcionales y postranscripcional y postraduccionales. Avances en la secuenciación del RNA profunda permiten el estudio de los niveles de mRNA de estado estacionario en una escala genoma-ancha en un nivel sin precedentes. Sin embargo, hallazgos recientes revelaron que nivel de mRNA de estado estacionario no se correlaciona siempre con proteína producción1,2. El destino de una transcripción individual es muy complejo y depende de muchos factores como estímulos internos/externos, estrés, etcetera. Regulación de la expresión génica durante la síntesis de proteína proporciona otra capa de control de expresión necesaria para una respuesta rápida en condiciones cambiantes. Polysome (o “polyribosome”) de perfiles, la separación y visualización de la traducción activa de ribosomas, es un poderoso método para estudiar la regulación de la síntesis de proteínas. Aunque sus primeras aplicaciones experimentales aparecieron en la década de 19603, polysome perfilado es actualmente una de las técnicas más importantes en la proteína traducción estudios4. MRNAs individuales puede ser traducida en más de un ribosoma a la formación de un polysome. Las transcripciones pueden ser estancadas en los ribosomas con cicloheximida5 y mRNAs que contienen diferentes cantidades de polisomas pueden ser separados en el proceso de fraccionamiento polysome por ultracentrifugación gradiente de sacarosa6,7 , 8 , 9. Análisis de ARN de fracciones polysomal entonces permite la medición de cambios en los Estados traslacionales de mRNAs individuales a escala de todo el genoma y en diferentes condiciones fisiológicas4,7, 10. el método se ha utilizado también para revelar el papel de la 5′ UTR y 3′ UTR secuencias en el control del ARNm traducción11, examinar el papel de miRNAs en represión traduccional12, descubrir defectos en biogénesis del ribosome13 y entender el papel de las proteínas del ribosoma asociados con enfermedades humanas14,15. Durante la última década, ha surgido un creciente papel para la regulación de la expresión génica durante la traducción que ilustra su importancia en enfermedades humanas. Las pruebas de control traduccional en cáncer, metabólico y enfermedades neurodegenerativas son abrumador15,16,17,18. Por ejemplo, dysregulation de eIF4E-dependiente control traduccional contribuye al autismo relacionadas con déficits15 y FMRP participa en estancamiento de los ribosomas en mRNAs vinculados al autismo14. Así, polysomal de perfiles es una herramienta muy importante para el estudio de defectos en la regulación traduccional en múltiples enfermedades humanas.
Análisis de la proteína de las fracciones polysomal bajo diferentes condiciones fisiológicas analiza la función de los factores asociados a los ribosomas durante la traducción. La técnica de generación de perfiles polysome se ha utilizado en muchas especies incluyendo levaduras, células de mamíferos, plantas y protozoos10,19,20,21. Parásitos protozoos como Trypanosoma y Leishmania presentan limitado control transcripcional de la expresión génica. Sus genomas se organizan en grupos de gen policistrónico que carecen de transcripción regulada por el promotor22. En cambio, expresión génica desarrollo predominante está controlada a nivel de la proteína traducción y estabilidad del mRNA en tripanosomatídeos especies23,24. Por lo tanto, la comprensión de control traduccional en la ausencia de regulación transcripcional es particularmente importante para estos organismos. Perfiles de polysomal es una poderosa herramienta para estudiar la regulación postranscripcional de la expresión génica en Leishmania25,26,27,28.
Los recientes avances en la detección de niveles de los mRNAs por real tiempo cuantitativo PCR (RT-qPCR) y transcriptoma completo de secuenciación de próxima generación, así como tecnologías de proteómica, trae ventajas de perfiles polysomal a un nuevo nivel y resolución. El uso de estos métodos puede ampliarse aún más por el análisis de fracciones individuales de polysomal por la secuencia de RNA profunda combinada con análisis proteómico para supervisar el estado traslacional de las células en una escala genoma-ancha. Esto permite la identificación de nuevos actores moleculares regular traducción bajo diferentes condiciones fisiológicas y patológicas. Aquí, presentamos un universal polysome perfiles de protocolo que se utiliza en tres modelos diferentes: el parásito Leishmania major, células humanas cultivadas y tejidos animales. Presentamos consejos sobre la preparación de lisados de células de diferentes organismos, optimización de condiciones de gradiente, de inhibidores de la Rnasa y aplicación de RT-qPCR, Western blot y electroforesis de RNA para analizar fracciones polysome en este estudio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Fraccionamiento polysome por gradiente de sacarosa combinada con ARN y análisis de la proteína de las fracciones es un método poderoso para analizar estado traslacional de mRNAs individuales o el conjunto translatome, así como roles de factores de la proteína de regulación traduccional maquinaria durante el normal estado fisiológico o enfermedad. Polysomal perfilado es una técnica especialmente adecuada para el estudio de regulación traduccional en organismos como trypanosomátidos incluyendo Leishmania…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen Ching Lee ayuda con grabación de audio. La investigación fue apoyada por los fondos de puesta en marcha de la Texas Tech University Health Sciences Center y por el centro de excelencia de Neurociencia traslacional y terapéutica (CTNT) concede reposo PN 2017-05 AKHRJDHW a A.L.K.; en parte por subvenciones de NIH R01AI099380 K.Z. James C. Huffman y Kristen R. Baca eran eruditos CISER (centro para la integración de la madre educación e investigación) y fueron apoyados por el programa.
Materials
| Instruments: | ||
| Gradient master | Biocomp Instruments Inc. | 108 |
| Piston Gradient Fractionator | Biocomp Instruments Inc. | 152 |
| Fraction collector | Gilson, Inc. | FC203B |
| NanoDrop One | Thermo Scientific | NanoDrop One |
| Nikon inverted microscope | Nikon | ECLIPSE Ts2-FL/Ts2 |
| 2720 Thermal Cycler | Applied Biosystems by Life Technologies | 4359659 |
| CO2 incubator | Panasonic Healthcare Co. | MCO-170A1CUV |
| HERATHERM incubator | Thermo Scientific | 51028063 |
| Biological Safety Cabinet, class II, type A2 | NuAire Inc. | NU-543-400 |
| Revco freezer | Revco Technologies | ULT1386-5-D35 |
| Beckman L8-M Ultracentifuge | Beckman Coulter | L8M-70 |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 |
| Ultracentrifuge Rotor SW41 | Beckman Coulter | 331362 |
| Swing-bucket rotor | Eppendorf | A-4-62 |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-45-30-11 |
| Quant Studio 12K Flex Real-Time PCR machine 285880228 | Applied Biosystems by life technologies | 4470661 |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0102 |
| Hemacytometer | Hausser Scientific | 02-671-51B |
| Software | ||
| Triax software | Biocomp Instruments Inc. | |
| Materials: | ||
| Counting slides, dual chamber for cell counter | Bio-Rad | 145-0011 |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | USA Scientific | 1615-5500 |
| Open-top polyclear centrifuge tubes, (14 mm x 89 mm) | Seton Scientific | 7030 |
| Syringe, 5 mL | BD | 309646 |
| BD Syringe 3 mL23 Gauge 1 Inch Needle | BD | 10020439 |
| Nunclon Delta Surface plate, 14 cm | Thermo Scientific | 168381 |
| Nunclon Delta Surface plate, 9 cm | Thermo Scientific | 172931 |
| Nalgene rapid-flow 90mm filter unit, 500 mL, 0.2 aPES | Thermo Scientific | 569-0020 |
| BioLite 75 cm3 flasks | Thermo Scientific | 130193 |
| Nunc 50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339653 |
| Chemicals: | ||
| Trizol LS | Ambion by Life Technologies | 10296028 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-500 |
| Trizma base | Sigma | T1378-5KG |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (DMEM) | Sigma | D6429-500ML |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F0926-50ML |
| Penicillin-Streptomycin (P/S) | Sigma | P0781-100ML |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 |
| Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) | Sigma | D8537-500ML |
| Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2x6H2O) | Acros Organics | AC413415000 |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma | P9541-500G |
| Nonidet P 40 (NP-40) | Fluka (Sigma-Aldrich) | 74385 |
| Recombinant Rnasin Ribonuclease Inhibitor | Promega | N2511 |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3993-1MU |
| cOmplete Mini EDTA-free protease inhibitors | Roche Diagnostics | 11836170001 |
| Glycogen | Thermo Scientific | R0551 |
| Water | Sigma | W4502-1L |
| Cycloheximide | Sigma | C7698-1G |
| Chloroform | Fisher Scientific | 194002 |
| Dithiotreitol (DTT) | Fisher Scientific | BP172-5 |
| Ethidium Bromide | Fisher Scientific | BP-1302-10 |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium dehydrate (EDTA) | Fisher Scientific | S316-212 |
| Optimem | Life Technologies | 22600050 |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma | P8833-100MG |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3KG |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T4049-100ML |
| Hgh Capacity cDNA Reverse Transcriptase Kit | Applied Biosystems by life technologies | 4368814 |
| Power SYBR Green PCR Master Mix | Applied Biosystems by life technologies | 4367659 |
| HCl | Fisher Scientific | A144SI-212 |
| Isopropanol | Fisher Scientific | BP26324 |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma | 221473-500G |
| Anti-RPL11 antibody | Abcam | ab79352 |
| Ribosomal protein S6 (C-8) antibody | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-74459 |
| 1xM199 | Sigma | M0393-10X1L |
| Lithium cloride | Sigma | L-9650 |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 |
| Gel Loading Buffer II | Thermo Scientific | AM8546G |
| UltraPure Agarose | Thermo Scientific | 16500-100 |
| Trichloracetic acid (TCA) | Fisher Scientific | A322-100 |
| SuperSignal West Pico PLUS chemiluminescent substrate | Thermo Scientific | 34580 |
| Formaldehyde | Fisher Scientific | BP531-500 |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L5750-1KG |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) | Sigma | P7626-5G |
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate (ATP) | Sigma | A1852-1VL |
| Cytosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate (CTP) | Sigma | C1506-250MG |
| Uridine 5'-triphosphate trisodium salt hydrate (UTP) | Sigma | U6625-100MG |
| Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate (GTP) | Sigma | G8877-250MG |
| SP6 RNA Polymerase | NEB | M0207S |
| Pyrophoshatase | Sigma | I1643-500UN |
| Spermidine | Sigma | S0266-1G |
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