Özet

Un modelo de ratón quimérico hígado humano de hipercolesterolemia familiar con hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas

Published: September 15, 2018
doi:

Özet

Aquí, presentamos un protocolo para generar un modelo de ratón quimérico hígado humano de hipercolesterolemia familiar usando hepatocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanas. Este es un modelo valioso para probar nuevos tratamientos para la hipercolesterolemia.

Abstract

Hipercolesterolemia familiar (FH) en su mayoría es causado por mutaciones de lipoproteína de baja densidad (LDLR) del receptor y los resultados en un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular inicio temprano debido a la marcada elevación del colesterol de LDL (LDL-C) en sangre. Las estatinas son la primera línea de fármacos hipolipemiantes para el tratamiento de FH y otros tipos de hipercolesterolemia, pero están surgiendo nuevos enfoques, en particular anticuerpos PCSK9, que ahora se están probando en ensayos clínicos. Para explorar nuevos enfoques terapéuticos para FH, nuevos fármacos o nuevas formulaciones, necesitamos apropiados modelos en vivo . Sin embargo, las diferencias en los perfiles metabólicos de lípidos en comparación con los seres humanos son un problema clave de los modelos animales disponibles de FH. Para solucionar este problema, hemos generado un modelo de ratón quimérico hígado humano usando la célula de vástago de pluripotent FH inducida (iPSC)-derivado de hepatocitos (iHeps). Se utilizaron ratones/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG) para evitar el rechazo inmune de las células humanas trasplantadas y a evaluar el efecto del LDLR-iHeps deficientes en un LDLR nulo fondo. IHeps FH trasplantado podría repoblar 5-10% del hígado de ratón LRG, basado en la coloración de la albúmina humana. Además, el iHeps implantada había respondido a fármacos hipolipemiantes y recapituló las observaciones clínicas de la eficacia creciente de anticuerpos PCSK9 en comparación con las estatinas. Nuestro modelo quimérico hígado humano así podría ser útil para la prueba preclínica de terapias nuevas para FH. También se puede generar utilizando el mismo protocolo, ratones quiméricos hígados humanos similares para otras variantes genéticas de FH o correspondientes a otras enfermedades hepáticas hereditarias, mutaciones.

Introduction

Receptor de la lipoproteína de baja densidad (LDLR) captura el colesterol LDL (LDL-C) en sangre para modular la síntesis de colesterol en el hígado. Mutaciones en el gen LDLR son la causa más frecuente de hipercolesterolemia familiar (FH)1. Las estatinas han sido tradicionalmente la primera línea de medicamentos para tratar el FH y otros tipos de hipercolesterolemia (heredado o adquirido). Las estatinas inhiben la 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima reductasa para reducir la síntesis del colesterol en el hígado2. Además, las estatinas aumentan los niveles de LDLR en la superficie del hepatocito para promover la separación de C-LDL del plasma. Sin embargo, una advertencia importante del tratamiento con estatinas es que al mismo tiempo inducen la expresión de cualquiera convertasa subtilisin/hexin 9 (PCSK9), una enzima que se une a LDLR para promover su degradación3. Este efecto es responsable de la insuficiente o incluso nula respuesta a las estatinas observadas en muchos pacientes. Estudiar este mecanismo, inesperadamente, lleva al descubrimiento de una forma alternativa para tratar la hipercolesterolemia. PCSK9 anticuerpos recientemente aprobados por la FDA en la actualidad se están utilizando en ensayos clínicos y mostrar mayor eficacia y mejor tolerancia que las estatinas4. El éxito de PCSK9 anticuerpos también implica que puede haber otras posibilidades terapéuticas para modular la vía de degradación de LDLR (además de PCSK9) en pacientes con hipercolesterolemia. Asimismo, existe interés en el desarrollo de nuevos inhibidores de PCSK9 distintos anticuerpos, por ejemplo, siRNA oligos5.

Para probar terapias nuevas para FH y en general cualquier otro tipo de hipercolesterolemia, apropiado en vivo modelos son necesarios. Un problema importante de la actual en vivo modelos, sobre todo ratones de6 y7, de conejos son sus diferencias fisiológicas con los seres humanos. Fundamentalmente, estos problemas incluyen un perfil metabólico de lípidos diferentes. La generación de animales quiméricos hígado humano8 podría ayudar a superar esta advertencia. El ratón quimérico hígado humano es un tipo de ratón “humanizado” con su hígado con hepatocitos humanos, por ejemplo, hepatocitos primarios humanos (pHH)9. Un problema con pHH es que no puede ser ampliada ex vivo, rápidamente pierden su función al aislamiento, y son una fuente limitada. Una alternativa a HPH es el uso de células madre pluripotentes inducidas (iPSC)-derivado de hepatocitos (iHeps)10. En particular, iPSCs son específicos para cada paciente y puede crecer indefinidamente, por lo que iHeps puede ser producido según la demanda, que es una ventaja significativa sobre HPH fresco. Por otra parte, iPSCs puede también ser fácilmente genéticamente modificados con nucleasas diseñador para corregir o introducir mutaciones en un segundo plano isogénicas para permitir comparaciones más fiel11.

Ratón quimérico hígado humano con pHH engrafted demuestran semejanzas a los seres humanos en perfiles metabólicos hígados, drogas respuestas y susceptibilidad a virus de hepatitis infección12. Esto los hace un buen modelo para el estudio de la hiperlipidemia en vivo. Los modelos de ratón más utilizados se basan en la/Fah– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (RFA) ratón13 y la uPA Ratón transgénico8, en que hasta el 95% del ratón hígado puede reemplazarse por pHH. Curiosamente, un informe reciente describió un humano FH hígado quimérico ratón (basado en el ratón de la RFA) con pHH de un paciente que llevaba una de mutación homocigótica de LDLR 14. En este modelo, los hepatocitos humanos repoblados no tenían funcional LDLR, pero hicieron los hepatocitos ratón residual, reduciendo así la utilidad de realizar en vivo pruebas de drogas confiando en el camino del LDLR.

Aquí, Divulgamos un protocolo detallado basado en nuestro trabajo recientemente publicado15 de engrafting FH iHeps en el hígado de ratón/Ldlr– / –/Rag2– / –/Il2rg– / – (LRG). Este ratón quimérico hígado humano es útil para modelos FH y la realización de pruebas de drogas en vivo.

Protocol

Todos los métodos aquí descritos que implican el uso de animales han sido aprobados por el Comité sobre el uso de animales viven en docencia e investigación (CULATR) de la Universidad de Hong Kong. 1. preparación y las pruebas fenotípicas de ratón Generación de ratones knockout (KO) de inmunodeficientes Ldlr . Utilice ratones cepas Ldlr- / -, Rag2- / -y Il2rg- / – (véase …

Representative Results

Dirigido iPSCs diferenciación humana en iHepsAl llegar a la confluencia de 70%, iPSCs humanas se distinguen en iHeps con un protocolo de 3 pasos16 (panel superior de lafigura 1 ). Después de 3 días de diferenciación de endodermo, iPSC colonias ser aflojadas extendiéndose a confluencia completo (panel inferior de lafigura 1 ). Luego, con 2 medio etapa dend , hepatoblasts…

Discussion

Estudios previos usando iHeps en roedores han confirmado que son una manera eficaz para el estudio de enfermedades hepáticas hereditarias17. Aún más ampliar el uso de esta tecnología y porque los modelos animales de FH actuales son subóptimos, engrafted FH iHeps en ratones LRG y demostró que la implantada LDLR +- o heterozigótica LDLR-iHeps FH mutado puede reducir el nivel de C-LDL del plasma de ratones y responder a la reducción de lípidos drogas en vivo.

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Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Shenzhen Ciencia y tecnología Consejo básico programa de investigación (JCYJ20150331142757383), programa de investigación prioridad estratégica de la Academia China de Ciencias (XDA16030502), Hong Kong Research Grant Consejo tema investigación Esquema (T12-705/11), programa de cooperación del Consejo de becas de investigación de la región administrativa especial de Hong Kong y la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (N-HKU730/12 y 81261160506), equipo proyecto de investigación de Ciencias naturales de Guangdong Fundación (2014A030312001), Guangzhou ciencia y tecnología programa (201607010086) y la provincia de Guangdong programa ciencia y tecnología (2016B030229007 y 2017B050506007).

Materials

Materials
40 µm Cell strainer BD B4-VW-352340
6-Well plate Thermofisher 140675 Extracellular matrix coated
Accutase Millipore SCR005
Acetylcholine Sigma Aldrich A6625 Dissolve in water
Antigen retrieval solution IHC World IW-1100-1L
Calcium chloride Sigma Aldrich C8106 CaCl2
Cell dissociation enzyme Thermofisher 12604-013 TrypLE
D-glucose Sigma Aldrich D8270
Dimethyl sulfoxide Sigma Aldrich D5879 DMSO
DMEM Thermofisher 10829 Knockout DMEM
DNase I Roche 11284932001
EDTA USB 15694 0.5 M, PH=8.0
Extracellular matrix (for cell suspension) Corning 354234 Matrigel
Extracellular matrix (for iHep differentiation) Corning 354230 Matrigel
Hepatocyte basal medium Lonza CC-3199
Hepatocyte culture medium Lonza CC-3198
High-fat and high-cholesterol diet Research Diet D12079B
Human Activin A Peprotech 120-14E
Human hepatocyte growth factor Peprotech 100-39
Human iPSC maintenance medium STEMCELL Technologies 5850 mTeSR1
Human oncostatin M Peprotech 300-10
Ketamine 10% Alfasan N/A
L-glutamine Thermofisher 35050
LDL-C detection kit WAKO 993-00404 and 993-00504
Magnesium chloride VWR P25108 MgCl2
Meloxicam Boehringer Ingelheim NADA 141-213
Monopotassium phosphate USB S20227 KH2PO4
Non-essential amino acids Thermofisher 11140
PBS GE SH30256.02 Calcium and magnesium-free
PCSK9 antibodies Sanofi and Regeneron Pharmaceuticals SAR236553/REGN727 Alirocumab
Phenobarbital Alfamedic company 013003
Phenylephrine RBI P-133 Dissolve in water
Potassium chloride Sigma Aldrich P9333 KCl
Povidone-iodine Mundipharma Betadine
Recombinant mouse Wnt3a R&D Systems 1324-WN-500/CF
ROCK inhibitor Y27632 Sigma Aldrich Y0503-5MG
RPMI 1640 Thermofisher 21875
Serum replacement Thermofisher 10828
Silicone coated petri dish Dow Corning Sylgard 184 silicone elastomer kit
Simvastatin Merck Sharp & Dohme ZOCOR
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S6297 NaHCO3
Sodium chloride Sigma Aldrich S7653 NaCl
Trypan blue solution 0.4% Thermofisher 15250061
U-46619 Cayman 16450 Dissolve in DMSO
Xylazine 2% Alfasan N/A
β-mercaptoethanol Thermofisher 31350
Name Company Catalog Number Yorumlar
Antibodies
AAT DAKO A0012 1:400
ALB Bethyl Laboratories A80-129 1:200
ASGPR Santa Cruz Sc-28977 1:100
HNF4A Santa Cruz Sc-6557 1:35
NANOG Stemgent 09-0020 1:200
OCT4 Stemgent 09-0023 1:200
Name Company Catalog Number Yorumlar
Mice
Il2rg-/- Jacson lab 003174
Ldlr-/- Jacson lab 002077
Rag2-/- Jacson lab 008449
Name Company Catalog Number Yorumlar
Equipments
Automated cell counter Invitrogen Countess
Gamma irradiator MDS Nordion Gammacell 3000 Elan II
Insulin syringe BD 324911
Powerlab ADInstruments Model 8/30
Slides scanning system Leica biosystems Aperio scanScope system
Sliding Microtome Leica biosystems RM2125RT
Stereomicrocope Nikon SMZ800
Tissue processing system Leica biosystems ASP200S
Wire myograph DMT 610M
Name Company Catalog Number Yorumlar
Softwares
Digital slide viewing software Leica Aperio ImageScope Version 12.3.2
Image J NIH Version 1.51e
Image processing software Adobe Photoshop CC Version 2015
Microscope imaging software Carl Zeiss AxioVision LE Version 4.7

Referanslar

  1. Brown, M. S., Goldstein, J. L. A receptor-mediated pathway for cholesterol homeostasis. Science. 232 (4746), 34-47 (1986).
  2. Endo, A. The discovery and development of HMG-CoA reductase inhibitors. J Lipid Res. 33 (11), 1569-1582 (1992).
  3. Dubuc, G., et al. Statins upregulate PCSK9, the gene encoding the proprotein convertase neural apoptosis-regulated convertase-1 implicated in familial hypercholesterolemia. Arterioscler Thrombo Vasc Biol. 24 (8), 1454-1459 (2004).
  4. Robinson, J. G., et al. Efficacy and safety of alirocumab in reducing lipids and cardiovascular events. N Engl J Med. 372 (16), 1489-1499 (2015).
  5. Fitzgerald, K., et al. Effect of an RNA interference drug on the synthesis of proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) and the concentration of serum LDL cholesterol in healthy volunteers: a randomised, single-blind, placebo-controlled, phase 1 trial. Lancet. 383 (9911), 60-68 (2014).
  6. Ishibashi, S., et al. Hypercholesterolemia in low density lipoprotein receptor knockout mice and its reversal by adenovirus-mediated gene delivery. J Clin Invest. 92 (2), 883-893 (1993).
  7. Watanabe, Y. Serial inbreeding of rabbits with hereditary hyperlipidemia (WHHL-rabbit). Atherosclerosis. 36 (2), 261-268 (1980).
  8. Carpentier, A., et al. Engrafted human stem cell-derived hepatocytes establish an infectious HCV murine model. J Clin Invest. 124 (11), 4953-4964 (2014).
  9. Tateno, C., et al. Near completely humanized liver in mice shows human-type metabolic responses to drugs. Am J Pathol. 165 (3), 901-912 (2004).
  10. Basma, H., et al. Differentiation and transplantation of human embryonic stem cell-derived hepatocytes. Gastroenterology. 136 (3), 990-999 (2009).
  11. Soldner, F., et al. Generation of isogenic pluripotent stem cells differing exclusively at two early onset Parkinson point mutations. Cell. 146 (2), 318-331 (2011).
  12. Bissig, K. D., et al. Human liver chimeric mice provide a model for hepatitis B and C virus infection and treatment. J Clin Invest. 120 (3), 924-930 (2010).
  13. Azuma, H., et al. Robust expansion of human hepatocytes in Fah(-/-)/Rag2(-/-)/Il2rg(-/-) mice. Nat Biotechnol. 25 (8), 903-910 (2007).
  14. Bissig-Choisat, B., et al. Development and rescue of human familial hypercholesterolaemia in a xenograft mouse model. Nat Commun. 6, 7339 (2015).
  15. Yang, J., et al. Generation of human liver chimeric mice with hepatocytes from familial hypercholesterolemia induced pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 8 (3), 605-618 (2017).
  16. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  17. Chen, Y., et al. Amelioration of hyperbilirubinemia in gunn rats after transplantation of human induced pluripotent stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Rep. 5 (1), 22-30 (2015).
  18. Ortmann, D., Vallier, L. Variability of human pluripotent stem cell lines. Curr Opin Genet Dev. 46, 179-185 (2017).
  19. Liu, H., Kim, Y., Sharkis, S., Marchionni, L., Jang, Y. Y. In vivo liver regeneration potential of human induced pluripotent stem cells from diverse origins. Sci Transl Med. 3 (82), 82ra39 (2011).

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Yang, J., Wong, L., Tian, X., Wei, R., Lai, W., Au, K., Luo, Z., Ward, C., Ho, W., Ibañez, D. P., Liu, H., Bao, X., Qin, B., Huang, Y., Esteban, M. A., Tse, H. A Familial Hypercholesterolemia Human Liver Chimeric Mouse Model Using Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocytes. J. Vis. Exp. (139), e57556, doi:10.3791/57556 (2018).

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