Burada, biz mevcut her iki mimari beyannamedir bir 3D organotypic Melanom küresel Cilt modeli oluşturmak için bir protokol ve bir organ/tümör vivo içinde ama aynı zamanda çok hücreli karmaşıklık barındırır sistematik deneysel müdahale.
Malign transformasyon melanosit, insan derisi, pigment hücrelerinin, melanom, artan metastatik potansiyeli olan son derece saldırgan bir kanser oluşumuna neden olur. Son zamanlarda, mono-chemotherapies Melanom belirli birleşimi terapileri ile hedeflenen kinaz inhibitörleri tarafından geliştirmeye devam. Yine de, tümörleri birincil direnç gösteren veya yeni tedaviler, böylece tumorigenic kapasite yeniden kazanmak için direnç geliştirmek çünkü metastatik Melanom yaşamı tehdit eden bir hastalık kalır. Malign melanom tedavi başarısını artırmak için moleküler mekanizmaları konvansiyonel tedavi yaklaşımları karşı direnç veriyor belirlenmesi gereklidir; Ancak, yenilikçi hücresel vitro modelleri gerektirir. Burada, yeni görüşler beyan ve malign melanom vivo içinde mimarisini tasvir bir vitro üç boyutlu (3D) organotypic Melanom küresel modeli tanıtmak içi-tumoral yanı sıra tümör-ana etkileşimler. Model olgun ve farklılaştırılmış Melanom pulcuklarının birincil cilt hücrelerinin oluşan bir 3D insan tam cilt yeniden yapılanma modeli tanımlanmış numaralarını içerir. Katıştırılmış Melanom pulcuklarının hücresel kompozisyon ve farklılaşma durumunu kutanöz Melanom metastazı içinde vivobirine benzer. Platform eleme bir ilaç için cevaplama tanımlaması desteklemiyor olabilir gibi bu organotypic Melanom küresel model kullanarak kombinasyon tedavileri, seçili olmayan böylece yararına artan cevaplama için gereksiz tedavi yük tutumlu süre tedavi müdahaleler.
İnsan derisi vücut koruma konusunda olumsuz çevresel etkileri1‘ den farklı işlevlere hizmet eden iki ayrı bölmeleri oluşur. Alt dermal bölmenin bir fibro-elastik bağ dokusu oluşur. Gevşek bağlı kollajen ve elastin lifleri mekanik bariyer fonksiyonu hizmet fibroblastlar tarafından sentezlenen oluşur. Dermisin üst epidermis bir hücre dışı matriks nedeniyle her iki cilt bölmeleri arasında sürekli bir iletişim olarak üretilen bazal lamina ayrılır. Dermis, aksine epidermis skuamöz epitel keratinositler esas olarak oluşan olduğunu ve dört katmanlara ayrılır. Stratum basale sürekli cilt progenitor hücrelerini stratum spinosum ve stratum granulosum aşamalarından stratum korneum stratifying türetilen farklılaşmamış bazal Lenfositi oluşur vücudu su kaybı ve enfeksiyonlar2den korumak için. Melanosit bazal membran hizalanır ve birden çok Lenfositi ile dendritik uzantıları aracılığıyla iletişim. Deri dokusu deri yaşlanma, immünosupresyon, inflamasyon ve indüksiyon Sigara Melanom cilt kanseri gibi UV radyasyon olumsuz etkilerinden korumak için pigment melanin üretiyorlar. UV ışınlarına katkı dönüşümü ile Malign Melanom melanositlerin be altında hala3tartışma.
Melanom geliştirme farklı tümör ilerleme aşamaları Ayrıştırılan ve bazı genetik, morfolojik ve histolojik değişiklikler4tarafından karakterize. Her iki de novo kaynaklanan veya doğuştan gelen veya alınan nevus nedeniyle bir yerel dan iyi huylu neoplazi neden melanosit çoğalması artırın. Bu öncül lezyon ilk malign sahne alanı’na, radiyal büyüme aşaması (alp) devam edebilir atypic hücreleri içeren yapısal olarak değiştirilmiş displastik dokusuna dönüştürebilir. Bu erken tümör ilerleme aşaması radyal birkaç yerel olarak invazif hücrelerin papiller dermiste içinde gösterilen epidermiste Proliferasyona hücreleri ile karakterizedir. Sırasında sonraki dikey büyüme aşaması (VGP) Melanom hücreleri zaten dermis ve subkutan doku5derin parçalar sızmaya bazal lamina kırarak metastatik ve invaziv fenotip gösterir. Son olarak, metastatik Melanom (MM) en agresif ilerleme sahne sistemik klemple organlara karaciğer, akciğer ve beyin6gibi istila etmek için kan ve lenf sistemi boyunca yayılan metastatik hücrelerle temsil eder.
Bugüne kadar erken tanı cerrahi ile takip hala en etkili tedavi Malign Melanom ve kalır. Klasik kemoterapi rejimleri sadece küçük hayatta kalma parası8,9görüşmek çünkü uzak metastaz olan hastalar için prognoz ancak, özellikle yoksul7, kalır. Ancak, durgunluk onlarca yıl sonra son gelişmeler hedefli tedaviler oldukça Malign Melanom prognozunda iyileştirilmiştir.
Bozukluk iki büyük mitojenle aktif yolları, RAS-RAF-MEK-ERK ve PI3K-AKT-PTEN sinyalleşme yolları mevcut Melanom progresyon tuşu sürücüleri ne zaman özellikle yapısal proto-oncogenes BRAFV600 nokta mutasyonlar harekete geçirmek ve NRAS mevcut10vardır. Buna göre hedeflenen kinaz inhibitörleri icadı için metastatik melanom hastalarda terapötik yararı söz verdim. Bu noktaya yapılan klinik çalışmalarda çok sayıda metastatik melanom hastalarda önemli yararı elde değil. Kısmi, birincil direnç gösteren hastalar subpopulation ile neredeyse tüm yanıtlardır. Ayrıca, ikincil direnç relapse için önde gelen edinimi hastalar11,12çoğunda gözlendi.
Yalnız mutasyon durum analizi en etkili tedavi stratejisi geliştirmek için yeterli değildir netleşiyor. Yeni hızlı ve güvenilir tanı araçları sistematik olarak kaydetmek ve bireysel kanser hücrelerinin yanıt çözümlemek gereklidir. Şu anda kullanılabilir veri insan Melanom üzerinde büyük çoğunluğu iki boyutlu (2D) melanom hücre kültürleri elde etmiş olursunuz. 3D yetişkin tümör hücreleri, ancak, farklılaştırılmış kanser arasındaki hücreler arası çapraz karışma hücre altgrupları de kanser hücrelerinin ve çevredeki ev sahibi olmayan dönüştürülmüş doku sağlar. Bu nedenle, hangi Melanom geliştirilen preklinik tarama olarak kullanılmak üzere 3D ortamı yeniden oluşturmak en iyi model13,14.
Burada tanıtılan organotypic Melanom küresel Cilt modeli içi tumoral daha derin bir anlayış yeni trendleri garanti eder ve tümör-ana etkileşim ve tümör gelişiminin moleküler mekanizmaları incelemek için bir gelişmiş tarama platform sağlayabilir ve terapi direnç içinde belgili tanımlık gelecek.
En iyi garanti altına almak için fizyolojik ve cilt koşulları taklit vivo içinde yeniden yapılandırır, primer hücre kalitesi son derece önemlidir. Yukarıda belirtildiği gibi çocuk veya Doğum öncesi cilt hücrelerini en düşük farklılaşma sınıf göstermek ve bu nedenle en iyi tam kalınlıkta deri eşdeğerleri oluşturmak uygundur. İlk mümkün kalite kontrol Lenfositi tohum ve EGM (iletişim kuralı Bölüm 8.2 ve 8.3) jöleye sıcaklığına sonra 2 gün dermal daralma ölçüde olduğu. Dermal jelleri fibroblastlar en kaliteli en küçülür. Ayrıca, çok az veya çok fazla fibroblastlar entegrasyonu dermal kasılma ve sonuç olarak epidermal eki dermal yuvası bozabilen. Bu işlem bir kapsamlı çapraz-hadis dermal ve epidermal hücrelerin arasına gerektirdiğinden bu sırayla epidermal farklılaşma, tehlikeye sokacaktır.
Primer Hücre kalitesi de eleştirel hücre confluency gibi hücreleri geçirilmesi bağlıdır. Lenfositi ≥80% confluency için yetiştirilen iseniz hemen Proliferasyona durdurmak ve ayırt etmeye başlar. Bu nedenle onları 40-%70 confluency için passaging sırasında kültür ve Hayır passage 3-4 daha sonra kullanmak önemlidir. Fibroblastlar daha az duyarlıdır ama 4-6 geçiş daha sonra kullanılmamalıdır. Ayrıca tüm primer hücre ve hücre hatları organotypic Melanom küresel cilt modelleri oluşturmak için kullanılan kültürlü unutmayın antibiyotik özgür ve bu nedenle kirlenme riski yüksektir. Ancak, antibiyotik ilavesi tek tek hücre fizyolojisi değiştirir ve bu nedenle deri eşdeğerleri kalitesini azaltır.
Genel olarak, tümör küresel oluşumu neredeyse her türlü tümör hücre satırları ve aynı zamanda taze hasta malzemeden izole tümör hücreleri mümkündür. En iyi küresel boyutlar kazanıyor için ilk cep numarası ve/veya yetiştirme zaman kullanılan hücre türüne bağlı olarak değişebilir. 150-200 µm boyutuna kadar bir küresel içinde bulunan tüm hücreleri hala yeterince besin basit difüzyon yolu ile temin edilebilir. Sadece pulcuklarının boyutları ≥500 µm ile hücresel başkalaşım yüksek derecede göstermek ve sigara skarların tümör doku22tipik özelliklerini temsil eder.
Organotypic Melanom-küresel-cilt-burada geliştirilen model tümör-ana etkileşimler incelemek özellikle uygundur ve melanom uyuşturucu vivo içindealtında testi için-tarihlerde koşullar15. Yine de, melanom in vivo ortamda ilişkili tümör hücre tipleri bağışıklık hücreleri ve endotel hücreleri de dahil olmak üzere, çeşitli barındıran daha karmaşıktır. Uygun birincil bağışıklık hücreleri ilavesi MHC sorunları yüzler beri bu modellerin henüz yeterli bağışıklık tedavi yaklaşımları izlemek mümkün değildir.
Yine de, melanom pulcuklarının taze izole hasta malzemeden üretilen ve tam cilt yeniden yapılandırma dahil bir kez bireysel uyuşturucu olarak hizmet eleme platformlar. Bile entegrasyon Melanom metastazı adet cilt yeniden yapılandırır özel bir tedavi yaklaşımı içinde uyuşturucu kombinasyonları test etmek için akla yatkın. Preklinik testi organotypic 3D Deride Melanom modeli dahil olmak üzere yalnızca en umut verici yeni tedavi kavramları ileri klinik test içine böylece aşınma oranı bunun için potansiyel yeni tedavilerin azaltarak alınır sağlamak olasıdır hastalık ve klinik çalışmalarda tedavi başarı oranı artan.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Hanna Voersmann 3D organotypic Melanom-küresel-cilt-model kurma ve mükemmel iletişim kuralları sağlamak için teşekkür ederiz. Yazarlar ayrıca Silke Busch değerli teknik destek için teşekkür ederiz. İş BMBF e tarafından desteklenmiştir: Med programı “Melanom duyarlılığı” 031A423A.
fetal serum albumin (FCS) | Thermo Fisher Scientific | 10270106 | add 10 % to cell culture medium |
Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25300054 | 1X dilute in PBS |
RPMI | Thermo Fisher Scientific | 61870010 | for cultivation of melanoma cell lines |
DMEM | Thermo Fisher Scientific | 41965062 | for cultivation of primary fibroblasts |
Dispase | Gibco life technologies | 17105041 | 2U/ml, dissolve in PBS |
Collagen type I | BD Biosciences | 354249 | usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml |
24-well inserts Nunclon | Nunc | 140629 | 8 µm pore size; use standing, not hanging inserts! |
cell strainer | BD Falcon | 352360 | yellow |
Gentamycine | Thermo Fisher Scientific | 15750060 | dissolve in PBS |
Keralife keratincyte medium | Cell Systems | do not add FCS or antibiotics | |
Collagenase | SERVA | 17454 | NB4 standard grade |
juvenile human keratinocytes | Cell Systems | FC-0007 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
juvenile human fibroblasts | Cell Systems | FC-0001 | alternative to own preparation from juvenile foreskin |
DMEM [+] 4,5 g/l Glucose, [+] L- Glutamine, [-] L- Pyruvate |
Gibco life technologies | 41965 | mix 1:1 with Ham´s F-12 for MM medium; mix 3:1 with Ham´s F-12 for EGM medium |
Ham´s F-12 [+] L-Glutamine | Gibco life technologies | 21765-029 | add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15) |
EGF | Gibco life technologies | 13247-051 | add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium |
Calcium chloride | Merck Chemicals | 2381 | add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium |
Selenic acid | Alfa Aesar | 18851 | add 53 nM for the generation of EGM and MM medium |
Insulin | Lilly | HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E-0135 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
P-Ethanolamine | Sigma-Aldrich | P-0503 | add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Holo-Transferrine | Sigma-Aldrich | T-0665 | add 5 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Triiodthyronine | Sigma-Aldrich | T-6397 | add 20 pM for the generation of EGM and MM medium |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H-088816 | add 0.4 µg/ml for the generation of EGM and MM medium |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P-8783 | add 10 nM only for the generation of EGM medium |
Hepes | Sigma-Aldrich | H-3784 | add 15 mM for the generation of EGM and MM medium |
Serine | Sigma-Aldrich | S-4311 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
Cholinchloride | Sigma-Aldrich | C-7017 | add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium |
dFCS | Sigma-Aldrich | F-0392 Lot 086K0361 | add 2 % for the generation of EGM and MM medium |
Adenine | Sigma-Aldrich | A-9795 | add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium |
L-Glutamine | PromoCell | C-42209 | add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium |
Strontiumchloride | Sigma-Aldrich | 255521 | add 1 mM for the generation of EGM and MM medium |
anti cytokeratin 10 antibody | Dako | M7002 | 1:50 |
anti cytokeratin 14 antibody | Santa Cruz | sc-53253 | 1:200 |
anti laminin 5 antibody | Santa Cruz | sc-32794 | 1:50 |
anti filaggrin antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-13440 | 1:50 |
anti involucrin antibody | Acris Antibodies | AM33368PU | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled | LifeSpan Biosciences | LS-C153907 | 1:50 |
secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled | Jackson Immuno Research | 115-165-003 | 1:1000 |
DAPI | Sigma-Aldrich | 10236276001 | 1:100 |