Özet

CARIP-Seq y ChIP-Seq: métodos para identificar cromatina asociada RNAs y las interacciones DNA proteína en las células madre embrionarias

Published: May 25, 2018
doi:

Özet

Aquí, describimos los métodos para realizar ChIP-Seq y mapas de CARIP-Seq, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación, generar global epigenómica y RNA asociada a la cromatina en células madre embrionarias.

Abstract

Auto-renovación de células madre embrionarias (ES) y diferenciación se rige por señales extrínsecas e intrínsecas redes de factores de transcripción, reguladores epigenéticos y traducción posteriores modificaciones de las histonas que influyen combinatorially en el gene Estado de expresión de los genes cercanos. RNA se ha demostrado también al interactuar con diversas proteínas para regular la dinámica de la cromatina y expresión génica. Asociada a la cromatina RNA inmunoprecipitación (CARIP) seguida por secuenciación de próxima generación (CARIP-Seq) es un método novedoso para la encuesta de ARN asociado a proteínas de cromatina, mientras que de inmunoprecipitación de cromatina, seguida por secuenciación de próxima generación ( ChIP-Seq) es una técnica poderosa genómica para asignar la ubicación de modificaciones post-traduccionales de las histonas, factores de transcripción y epigenéticos modificadores a escala mundial en células madre embrionarias. Aquí, describimos los métodos para realizar CARIP-Seq y ChIP-Seq, incluyendo la construcción de la biblioteca para secuenciación de próxima generación, para generar ARN cromatina asociado global y mapas epigenómicos en células madre embrionarias.

Introduction

Las decisiones de destino de células madre embrionarias (ES) son reguladas por la comunicación entre las señales extracelulares y un anfitrión de transcripcional reguladores, como modificadores de histonas, modificación post traducción de colas de las histonas. Estas interacciones facilitan la accesibilidad de la cromatina y empaquetado de la cromatina en uno de dos Estados: eucromatina, que es abierto y transcripcionalmente activo, y la heterocromatina, que es compacto y generalmente transcripcionalmente inactiva. Factores de transcripción con afinidades de unión de la secuencia específica de ADN y modificadores epigenéticos asociados con regiones euchromatic para participar en el control de la expresión génica. Métodos de secuenciación de próxima generación, incluyendo ChIP-Seq1, han sido fundamentales en la asignación de redes transcripcionales del genoma que son fundamentales para ES celular auto renovación y pluripotencia2,3,4 ,5,6. Por otra parte, mientras que immunopreciation RNA seguido por generación de secuenciación (RIP-Seq)7 las evaluaciones de las interacciones RNA-proteína sugieren que proteínas ADN interactuarán con RNAs regulación transcripcional eventos7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, pocos estudios han investigado la localización de todo el genoma de ARN asociado con cromatina12o interacciones globales entre el ARN y la histona modificación. ARN largo no codificante (lncRNAs) es una clase de RNAs que se han encontrado para regular la actividad de las proteínas asociadas a cromatina13,14,15. Por ejemplo, Xist es un lncRNA que regula, en células de mamífero femenino, la inactivación de un cromosoma de X, a través de la contratación de represores epigenéticos16,17. Sin embargo, el espectro completo de RNAs asociados con cromatina es desconocido. Aquí, describimos un protocolo nuevo, asociada a la cromatina RNA inmunoprecipitación (CARIP) seguida por secuenciación de próxima generación (CARIP-Seq), para identificar ARN cromatina asociados sobre una base de todo el genoma en células madre embrionarias, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación y ChIP-Seq mapa ocupación global de modificaciones de las histonas, factores de transcripción y modificadores de la epigenéticos. A diferencia de otros métodos de RIP-Seq7, CARIP-Seq incluye pasos de reticulación y sonicación, que permiten la identificación directa de ARN asociada a la cromatina. Juntos, ChIP-Seq es una poderosa herramienta para identificar las interacciones de la proteína del genoma-ADN, mientras que CARIP-Seq es un método poderoso para RNAs asociados con componentes de la cromatina.

Protocol

1. cultura de ES de ratón células en condiciones libres de alimentador. Nota: Las células de ratón ES convencionalmente son cultivadas en medios de comunicación en una placa de cultivo celular recubierta de gelatina y una mono capa de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), que han sido inactivados mitotically (iMEFs). Sin embargo, MEFs deben eliminarse antes de abajo análisis epigenéticos o expresión para evitar la contaminación de la cromatina asociados por el MEF y el ARN. <ol…

Representative Results

Nos interrogó con éxito la Unión de todo el genoma de H3K4me3, H3K4me2 y KDM5B en células madre embrionarias usando este ChIP-Seq protocolo6. Células madre embrionarias fueron cultivados en condiciones libres de alimentación (figura 1) y reticulado como se describió anteriormente. Sonicación fue posteriormente realizado como se describe en el paso 3.2 del protocolo ChIP-Seq y evaluada mediante la ejecución de DNA en gel de aga…

Discussion

ChIP-Seq es un método útil para evaluar la situación de las interacciones proteína-ADN global (por ej., factores de transcripción/histona modificación de enzimas/histona modificaciones y ADN) en células madre embrionarias, mientras que el nuevo protocolo de CARIP-Seq es útil en interrogatorio de Asociación de genoma de ARN con los componentes de la cromatina. ChIP-Seq es una herramienta fundamental que se utiliza para evaluar paisaje epigenético de células madre embrionarias y otros tipos de células….

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por Wayne estado Universidad, Karmanos Cancer Institute, una beca de la National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) a B.L.K. Este trabajo utiliza el Wayne estado Universidad alto rendimiento Computación Grid de recursos computacionales (). Agradecemos Jiji Kurup ayuda con análisis de datos de CARIP-Seq.

CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES:

B.L.K. concibió el método de CARIP-Seq, diseñado y llevado a cabo los experimentos de ChIP-Seq y CARIP-Seq, analizó los datos de secuenciación y redactó el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado la versión final de este manuscrito.

Materials

Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) EMD Millipore 106 or 107 units
GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) Stemgent Solvent: DMSO 10mM
MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) Stemgent Solvent: DMSO 10mM
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose Invitrogen 11965092
PBS (phosphate buffered saline) Invitrogen 10010031
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red Gibco 25200056
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140122
2-Mercaptoethanol (50 mM) Gibco 31350010
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Gibco 11140076
EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml EMD Millipore ES-009-B
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution EMD Millipore ES-006-B
Glycine Sigma G7126-500G 1.25 M stock conentration in water
Formaldehyde solution Sigma F8775-500ML
TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X Quality Biological 351-011-131
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution Sigma 93482-250ML-F
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Roche 11697498001
Sodium dodecyl sulfate solution (20%) Quality Biological A611-0837-10
Q125 sonifier Qsonica 4422
Triton X-100 solution Sigma 93443-100ML
Sodium deoxycholate Sigma 30970
NaCl Sigma S7653
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation Invitrogen 10004D
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation Invitrogen 10002D
Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack Invitrogen 10015D
Lithium chloride Sigma L4408
IGEPAL CA-630 Sigma I8896
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104
Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) Invitrogen 61006
SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit Invitrogen 11917010
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
End-It DNA End-Repair Kit Lucigen ER81050
Klenow Fragment (3'→5' exo-) NEB M0212L
dATP (10 mM) Invitrogen 18252015
T4 DNA ligase NEB M0202L
TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder Invitrogen 10488085
E-gel EX agarose gels, 2% Invitrogen G402002
Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer Thermo Fisher F531LPM
ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody EMD Millipore 17-614
Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) Abcam ab32356
Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) Fisher 720083
Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) Fisher 08772E
Bioruptor pico Diagenode B01010001
Qubit Flurometer 2.0 Thermo Fisher
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32851
MinElute Reaction Cleanup Kit Qiagen 28204
MinElute Gel Extraction Kit Qiagen 28604
Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) Abcam ab9053
Labquake rotator Thermo Fisher 400110Q
Illumina HiSeq platform Illumina
TURBO DNase Invitrogen AM2238

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Kidder, B. L. CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (135), e57481, doi:10.3791/57481 (2018).

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