CARIP-Seq und ChIP-Seq: Methoden zur Ermittlung von Chromatin-assoziierter RNA und Protein-DNA-Wechselwirkungen in embryonale Stammzellen
Özet
Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von ChIP-Seq und CARIP-FF, einschließlich der Bibliothek Vorbereitung auf Next Generation Sequencing, global epigenomischen und Chromatin-assoziierter RNA zu generieren-Karten von ES-Zellen.
Abstract
Embryonale Stammzellen (ES) Zelle Selbsterneuerung und Differenzierung unterliegt extrinsische Signale und intrinsische Netzwerke von Transkriptionsfaktoren, epigenetische Regulatoren und Post-Übersetzung Modifikationen der Histone, die das Gen kombinatorisch beeinflussen Ausdruck Zustand des nahe gelegenen Gene. RNA hat sich auch gezeigt, zur Interaktion mit verschiedenen Proteinen, Chromatin Dynamik und Genexpression regulieren. Chromatin-assoziierter RNA Immunopräzipitation (CARIP) gefolgt von Next Generation Sequencing (CARIP-Seq) ist eine neuartige Methode zur RNA zugeordnete Chromatin Proteine, während Chromatin Immunopräzipitation gefolgt von Next Generation Sequencing (Umfrage ChIP-Seq) ist eine leistungsstarke Genomik-Technik, um den Lageplan des Post-translationale Modifikation der Histone, Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikatoren auf einer globalen Skala in ES-Zellen. Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von CARIP-Seq und ChIP-Seq, einschließlich Bibliotheksbau für Next-Generation Sequenzierung, um globale Chromatin-assoziierter RNA und epigenomischen Karten in Embryonaler Stammzellen zu erzeugen.
Introduction
Kommunikation zwischen extrazelluläre Signale und eine Reihe von transkriptionelle-Aufsichtsbehörden, einschließlich der Histon-Modifikatoren und Post-Übersetzung Änderung der Histone Tails sind embryonale Stammzellen (ES) Zelle Schicksal Entscheidungen geregelt. Diese Interaktionen Erleichterung Chromatin Zugänglichkeit und Verpacken von Chromatin in einen von zwei Zuständen: Euchromatin, das offen und transcriptionally aktiv ist, und Heterochromatin, das kompakt und in der Regel transcriptionally inaktiv ist. Transkriptionsfaktoren mit DNA-Sequenz-spezifische verbindliche Affinitäten und epigenetische Modifikatoren Associate bei euchromatisch Regionen zur Teilnahme bei der Kontrolle der Genexpression. Next Generation Sequencing-Methoden, einschließlich der ChIP-Seq1, haben bei der Kartierung genomweite transcriptional Netze, die grundlegend für ES Zelle Selbsterneuerung und Pluripotenz2,3,4 sind maßgeblich ,5,6. Darüber hinaus während der RNA Immunopreciation gefolgt von der nächsten Generation Sequenzierung (RIP-Seq)7 Bewertungen von RNA-Protein-Wechselwirkungen legen nahe, dass DNA-bindende Proteine RNAs interagieren regulieren transkriptionelle Ereignisse7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, haben nur wenige Studien untersucht die genomweite Lokalisierung von RNAs Chromatin12oder globale Wechselwirkungen zwischen RNA und Histon Änderungen zugeordnet. Lange nicht-kodierende RNAs (LncRNAs) sind eine Klasse von RNAs, die gefunden wurden, um die Tätigkeit von Chromatin-assoziierte Proteine13,14,15Regeln. Xist ist beispielsweise eine LncRNA, die im weiblichen Säugerzellen, Inaktivierung eines x-Chromosoms durch die Rekrutierung von epigenetischen Repressoren16,17regelt. Das gesamte Spektrum der RNAs zugeordnete Chromatin ist jedoch weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir eine neuartige Protokoll, Chromatin-assoziierter RNA Immunopräzipitation (CARIP) gefolgt von Next Generation Sequencing (CARIP-Seq), Chromatin-assoziierten RNAs auf einer genomweiten Basis in ES-Zellen, einschließlich Bibliothek Vorbereitung zu identifizieren für Next Generation Sequencing und ChIP-Seq globale Belegung von Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikatoren zuordnen. Im Gegensatz zu anderen RIP-Seq Methoden7enthält CARIP-Seq Vernetzung und Beschallung Schritte, die für die direkte Identifizierung von RNAs Chromatin zugeordnet zu ermöglichen. Gemeinsam ChIP-Seq ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur genomweiten Protein-DNA-Wechselwirkungen zu identifizieren, während CARIP-Seq ist eine leistungsfähige Methode zur Übersicht RNAs mit Chromatin Komponenten verbunden.
Protocol
Representative Results
Discussion
ChIP-Seq ist eine nützliche Methode, die Lage des globalen Protein-DNA-Wechselwirkungen zu bewerten (zB., Transkription Faktoren/Histon-modifizierende Enzyme/Histon Änderungen und DNA) in ES-Zellen, während der neu entwickelte CARIP-Seq-Protokoll nützlich ist abfragenden genomweite RNAs mit Chromatin Bestandteile. ChIP-Seq ist ein grundlegendes Instrument, das verwendet wird, um epigenetische Landschaften von ES-Zellen und andere Zelltypen zu bewerten. Die Qualität der ChIP-Seq und CARIP-Seq-Bibliotheken is…
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, ein Stipendium des National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) an B.L.K. vergeben unterstützt. Diese Arbeit genutzt, die Wayne State Universität High Performance Computing Grid für computational Ressourcen (). Wir danken für die Unterstützung bei CARIP-Seq Datenanalyse Jiji Kurup.
AUTOREN-BEITRÄGE:
B.L.K. der CARIP-Seq-Methode konzipiert, entworfen und ChIP-Seq und CARIP-Seq Experimente durchgeführt die Sequenzierungsdaten analysiert und erarbeitet das Manuskript. Alle Autoren haben gelesen und genehmigt die Endfassung des Manuskripts.
Materials
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) – ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] – ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody – ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
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